Medición de tumores de cabeza y cuello de ratón mediante análisis automatizado de imágenes CBCT

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12033 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Los experimentos con animales se utilizan a menudo para determinar los efectos de los fármacos y otras condiciones biológicas en la progresión del cáncer, pero la escasa precisión y reproducibilidad de los métodos de medición de tumores establecidos hacen que los resultados no sean fiables. En modelos ortotópicos de cáncer de cabeza y cuello en ratones, los volúmenes tumorales aproximados a partir de mediciones con calibre se utilizan convencionalmente para comparar grupos, pero los desafíos geométricos hacen que el procedimiento sea impreciso. Para abordar esto, desarrollamos un software para medir mejor estos tumores mediante el análisis automatizado de exploraciones por tomografía computarizada de haz cónico (CBCT). Esto permite realizar análisis de la forma del tumor y la dinámica de crecimiento que, de otro modo, serían demasiado inexactos para proporcionar información biológica. Al monitorear el crecimiento del tumor mediante calibradores e imágenes en paralelo, encontramos que las mediciones del calibrador de tumores pequeños están débilmente correlacionadas con el volumen real del tumor y son muy susceptibles al sesgo del experimentador. El método presentado proporciona una ventana única a las fuentes de error en un aspecto fundamental de la investigación preclínica del cáncer de cabeza y cuello y una herramienta valiosa para mitigarlos.

A pesar de los avances en el uso de organoides1 y tecnologías de órganos en chips2, los sistemas in vitro no logran reproducir aspectos cruciales de los tumores reales, que contienen una amplia gama de células estromales, interactúan con un sistema inmunológico sistémico y pueden metastatizarse en órganos distantes. . Los modelos de cáncer en ratones superan estas limitaciones y permiten experimentos controlados que comparan grupos de animales casi idénticos con manipulaciones farmacológicas y genéticas para probar hipótesis biológicas precisas. Por lo tanto, son de inmenso valor para mostrar que algo afecta el crecimiento del tumor o determinar por qué en un contexto donde el efecto puede verificarse directamente.

Desafortunadamente, los métodos utilizados para medir tumores en ratones suelen ser inexactos, requieren mucho tiempo y son susceptibles a diversas formas de sesgo. El volumen de un tumor palpable externamente normalmente se aproxima utilizando la siguiente fórmula (o similar) a partir de distancias medidas con calibradores:

donde dlong y dshort son las más largas y las más cortas de dos medidas aproximadamente ortogonales, respectivamente. Los detalles del procedimiento de medición, incluida la fuerza con la que se deben apretar los calibradores, probablemente contribuyan a errores aleatorios e inconsistencias entre los medidores. La medida en que la Ec. (1) sobreestimar o subestimar el volumen también depende, por supuesto, de la forma del tumor. Esto es particularmente pertinente en el cáncer de cabeza y cuello (CCH), donde los tumores pueden crecer de manera exofítica o endofítica a través de los agujeros e invadir los ganglios linfáticos adyacentes.

En cambio, el crecimiento de tumores que no son palpables externamente, como los tumores de pulmón3 o los tumores cerebrales4, se puede rastrear utilizando modalidades de imágenes médicas, incluida la tomografía computarizada (TC)5, la resonancia magnética (MRI)6 y la ecografía. Aunque esto puede proporcionar información útil, la aplicabilidad de la medición de tumores basada en imágenes para el seguimiento en serie de múltiples animales está limitada por los largos tiempos de adquisición y análisis de imágenes. Se ha informado anteriormente que la medición con calibrador es menos precisa que la medición basada en imágenes de los mismos tumores7,8. Las imágenes por bioluminiscencia (BLI) también son notables en este contexto como método para comparar el crecimiento de tumores apropiadamente etiquetados, aunque adolece de una serie de problemas técnicos9,10 y no se utiliza normalmente para estimar el volumen del tumor11.

Las mediciones del volumen del tumor mediante calibradores y el análisis manual de imágenes, simplemente mediante la participación directa de humanos, también permiten la inyección consciente o subconsciente de sesgo en los resultados. A pesar de la evidencia de tales efectos del experimentador y la importancia del registro ciego de datos12,13, no es una práctica común en este contexto y representa una ventaja importante de la automatización de la cuantificación del volumen del tumor.

Por lo tanto, buscamos desarrollar un método preciso de medición de tumores a través del análisis de imágenes automatizado que supere estas fuentes de error y, al mismo tiempo, sea lo suficientemente rentable como para permitir el monitoreo continuo del crecimiento del tumor en muchos animales durante el transcurso de un experimento como un sustituto directo. para medición de calibre. Con este fin, creamos un software que procesa imágenes de tomografía computarizada de haz cónico (CBCT) de dosis baja de hasta cinco ratones con tumores bucales, aísla los ratones individuales y segmenta las imágenes para calcular volúmenes e información adicional sobre cada tumor, sin necesidad de cualquier entrada del usuario. Presentamos un análisis preliminar de los datos generados por este software y las mediciones del calibrador para comparar.

Aunque todavía existen obstáculos importantes para el uso generalizado de CBCT para el seguimiento del crecimiento tumoral, esperamos demostrar que el desarrollo de tecnología para facilitarlo tiene una gran utilidad potencial para la investigación de HNC. También es importante reconocer que los métodos y resultados descritos aquí se relacionan con desafíos específicos de medir tumores bucales de ratón, que pueden no ser relevantes para tumores en otras ubicaciones. Además, debido a que no contamos con un método de medición estándar con el cual comparar los resultados, no podemos validar efectivamente la precisión de nuestro método como medición física. Estos resultados pretenden proporcionar una descripción detallada de las limitaciones de la medición con calibrador, específicamente de tumores bucales de ratón, y explorar aplicaciones de la segmentación por TC automatizada para el análisis de la forma del tumor y la tasa de crecimiento, dos áreas que hemos identificado como que se benefician sustancialmente de este tipo de software. .

La tomografía computarizada de haz cónico (CBCT), una forma de imagen por TC comúnmente utilizada en odontología y radioterapia, es capaz de adquirir rápidamente imágenes 3D con alta resolución en las tres dimensiones, lo cual es deseable para una medición precisa del volumen. Como prueba de concepto para el uso de nuestras imágenes CBCT para medir el volumen, escaneamos una colección de pequeños tubos alícuotas que contienen volúmenes conocidos de agua y utilizamos una secuencia de comandos de Python para segmentar la imagen (Figura complementaria S1A, B). Los volúmenes calculados a partir del número de vóxeles en cada región identificada como agua coincidieron muy bien con los volúmenes esperados en función del peso del agua cuando se pipeteó en los tubos (Figura complementaria S1C). En este caso, la segmentación de la imagen se logró mediante umbralización (los valores de los vóxeles en el agua son más altos que los del aire o el plástico), algún procesamiento de la imagen binaria para corregir las consecuencias del ruido y las rebabas, y la separación de los vóxeles de densidad del agua en componentes conectados. Si bien métodos similares también son aplicables a ratones, los tumores no se distinguen fácilmente de otros tejidos blandos en las imágenes de TC, por lo que se requirió un enfoque algo complicado para segmentarlos (Fig. 1a).

Monitoreo del crecimiento del tumor bucal mediante análisis automático de TC. (a) Diagrama de bloques conceptual del programa de análisis automático de CT. (b) Ilustraciones de la disposición de escaneo con múltiples ratones. (c) División automática de escaneos de múltiples mouse. La línea discontinua amarilla representa el número de vóxeles que representan el diente (aislado mediante umbralización) presentes en cada plano horizontal del escaneo, y las líneas discontinuas rojas indican puntos de división verticales detectados en él. (d) Eliminación de objetos no deseados del escaneo. (e) Proyecciones de máxima intensidad de una exploración representativa con puntos anotados automáticamente y brazos y cráneo resaltados para demostrar la segmentación ósea. La figura (e – g) y la figura complementaria S2C – G se generaron durante el análisis de la misma exploración. Los ejes están etiquetados de acuerdo con el sistema de coordenadas que se muestra en la figura complementaria S2A. (f) Proyecciones de intensidad máxima de la cabeza después de volver a muestrear en una orientación simétrica estándar. (g) (izquierda) Mapa de altura inicial del exceso de tejido en el lado derecho de la cabeza en comparación con el izquierdo, y (derecha) mapa de altura del exceso de tejido después del procesamiento 2D. Estas imágenes son pseudocolores lineales e incluyen toda la gama de datos. (h) Cortes coronales (izquierda) y axiales (derecha) de la exploración original con regiones segmentadas de hueso y dientes resaltadas en varios colores, así como el tumor en verde oscuro, y (abajo) representación 3D de la segmentación como se muestra arriba.

Utilizando etapas modificadas y configuraciones de anestesia (Fig. 1b, Fig. Suplementaria S1D), pudimos adquirir exploraciones CBCT de múltiples ratones a una velocidad comparable a la medición con calibrador (Fig. Suplementaria S1E, F), lo que la convierte en una alternativa viable para tumores. seguimiento a escala. Luego se requirió un procesamiento previo de las exploraciones resultantes para separar ratones individuales (Fig. 1c) y eliminar objetos que no fueran ratones (Fig. 1d). El método que desarrollamos para segmentar cada ratón aprovecha la simetría de la cabeza para identificar el tejido de un lado que no corresponde al tejido del otro. Este mapeo de izquierda a derecha se logra ajustando un sistema de coordenadas curvilíneo que se dobla con el cuello y la mandíbula. En contraste con el sistema de coordenadas natural de índices de vóxeles (Figura complementaria S2A), donde cada vóxel representa el mismo volumen de espacio, las coordenadas curvas definen una cuadrícula donde varía el volumen de espacio real representado por cada punto. Para tener en cuenta esto, los volúmenes en el espacio curvo se calcularon sumando volúmenes de 24 tetraedros por vóxel, dispuestos para contar todo el espacio real exactamente una vez (Figura complementaria S2B).

Utilizamos varias técnicas de procesamiento de imágenes, incluido el establecimiento de umbrales, el crecimiento de regiones, el registro de pequeños bloques de vóxeles y filtros para detectar características específicas, para segmentar primero los dientes (Figura complementaria S2C), luego el hueso (Figura 1e) y etiquetar varios de manera consistente. puntos identificables.

Al hacer coincidir los puntos del lado izquierdo del cuerpo con los puntos de la derecha e interpolar entre ellos, generamos una cuadrícula curvilínea de puntos en la que volver a muestrear cada mouse en una orientación simétrica (Figura complementaria S2D-G, Figura 1f) , que permite mapear trivialmente el tejido del lado izquierdo de la cabeza hacia el derecho y restarlo para detectar el crecimiento del tumor. Luego se filtró en 2D un mapa de altura del exceso de volumen de tejido en un lado (Fig. 1g) para producir un mapa de altura del tumor, que se proyectó nuevamente en la exploración 3D original para segmentar el tumor (Fig. 1h).

Para validar el software de segmentación automática, escaneamos los mismos ratones dos veces el mismo día con ubicaciones aleatorias en cada escaneo, para determinar en qué medida los volúmenes tumorales calculados están influenciados por variaciones de posicionamiento aleatorias. Los volúmenes fueron similares entre dos escaneos con tres o cinco ratones, y el uso de escaneos con cinco ratones de menor calidad con vóxeles de 0,2 mm, en comparación con escaneos con tres ratones de mayor calidad con vóxeles de 0,1 mm, no pareció sesgar significativamente los volúmenes calculados ( Figura 2a). Para comparar la repetibilidad con el método del calibrador, calculamos los volúmenes de un conjunto de tumores a partir de mediciones con calibrador realizadas con tres medidores diferentes y adquirimos tres conjuntos de exploraciones de los mismos ratones el mismo día. Los volúmenes del calibre variaron sustancialmente para todos los tamaños de tumor.

Repetibilidad de las mediciones del volumen del tumor. (a) Variación entre los volúmenes tumorales calculada a partir de dos exploraciones del mismo ratón el mismo día. (izquierda) para ambos escaneos usando la disposición de escaneo de 5 mouse (Fig. 1b) con vóxeles de 0,2 mm o ambos usando la disposición de escaneo de 3 mouse (Fig. Suplementaria S1D), y (derecha) de un escaneo de cada tipo. (b) Comparación de las mediciones del calibrador tomadas por 3 medidores separados frente al promedio de volúmenes calculados a partir de tres exploraciones diferentes (N = 18). Todas las demás mediciones de calibre informadas en este documento fueron recopiladas por el "Measurer One". Tenga en cuenta que los paneles (c) y (d) son representaciones diferentes de los mismos datos. (c) Comparación de variabilidad entre los resultados del calibrador de tres medidores (las barras horizontales representan su desviación estándar) y 3 mediciones de segmentación por TC consecutivas (las barras verticales representan su desviación estándar) de los mismos tumores el mismo día. (d) Comparación de las desviaciones estándar de los volúmenes medidos con un calibrador y los volúmenes medidos por TC para diferentes tamaños de tumor con líneas ajustadas de mínimos cuadrados (punteadas). (e) Comparación de volúmenes derivados del contorno manual de imágenes de TC con contraste mediante tres métodos diferentes, junto con los volúmenes calculados con regla de TC (calculados utilizando la ecuación (1) a partir de distancias medidas, como se muestra en la figura complementaria S3B) (N = 14). (f) Representaciones 3D de tres estilos de segmentación manual de un tumor representativo (fila superior) y corte coronal resaltado (fila inferior) de la segmentación manual de una tomografía computarizada con contraste representativa.

Un medidor tendió a registrar volúmenes más bajos que los demás, logrando una buena concordancia con los volúmenes de la segmentación CBCT (Fig. 2b) y recopiló todas las demás mediciones del calibrador informadas en este documento. Es importante destacar que los resultados de las mediciones con calibrador fueron menos similares a los del análisis CBCT automático en otros experimentos (Figura complementaria S3A). Las diferencias entre medidores son un problema importante con el método del calibrador, lo que resulta en inconsistencias obvias si una persona no recopila todas las mediciones del calibrador para un experimento determinado. La variabilidad entre las mediciones del calibrador de un tumor determinado tendió a ser mucho mayor que la variabilidad entre los volúmenes de segmentación CBCT de diferentes exploraciones, especialmente para tumores pequeños (Fig. 2c). Parece que los errores aleatorios en la medición del volumen mediante TC son aproximadamente proporcionales al volumen, mientras que un componente significativo de la variabilidad entre las mediciones del calibrador es independiente del volumen (Fig. 2d).

De manera similar, comparamos los resultados de la segmentación automática con la segmentación manual. Para este experimento, adquirimos exploraciones CBCT con contraste de 15 tumores grandes. Dos investigadores realizaron tres estilos diferentes de contorneado manual (Fig. 2e, f), utilizando el software ITK-Snap, y se incluyeron distancias medidas que se aproximaban a la medición del calibrador para comparaciones adicionales (Fig. Suplementaria S3B). Observamos una pobre concordancia entre estos métodos (Fig. 2e). A pesar de las diferencias visibles entre los estilos de contorno, vale la pena señalar que todas las segmentaciones parecen similares y razonablemente precisas cuando se superponen en los escaneos. Esto sugiere que para que la segmentación de imágenes manual (o semiautomática) dé resultados reproducibles se requerirían procedimientos muy rígidamente definidos. Este enfoque también requiere demasiado tiempo para presentar una alternativa viable a la segmentación automática para el seguimiento continuo de muchos tumores.

Si bien se observó una relación lineal entre los volúmenes tumorales de la segmentación CBCT automática y las mediciones con calibrador realizadas por el medidor de tumores primario cuando los tumores se midieron en un solo momento (Fig. 2b, "Medidor uno"), esto no se observó cuando las mediciones con calibrador y las exploraciones CBCT se recopilaron en paralelo en el transcurso de experimentos reales (Figura complementaria S3A). Se realizaron dos de estos experimentos, y todos los pares de volúmenes coincidentes (mediciones de TC y calibrador del mismo tumor el mismo día) se muestran en la Fig. 3a con ajustes lineales y cuadráticos. Parece que los volúmenes del calibrador inferiores a 200 mm3 fueron casi siempre mayores que el volumen de TC correspondiente y los volúmenes del calibrador superiores a 200 mm3 fueron casi siempre menores que el volumen de TC correspondiente. Un coeficiente de sólo 0,57 para el término de primer orden del ajuste lineal es particularmente preocupante, ya que sugiere que la medición con calibre subestima sustancialmente los cambios en el volumen del tumor.

Comparación de datos de volumen de CT y métodos de calibrador. (a) Los pares coincidentes de mediciones de volumen mediante métodos de calibrador y TC del mismo tumor en el mismo día (verde) se muestran con ajustes lineales y cuadráticos. (b) Los puntos negros representan pares coincidentes de (a). Las líneas de conexión para cada mouse se dibujan en colores aleatorios y pueden girar en puntos adicionales, donde solo están disponibles datos de calibre o ct para un día en particular y la otra coordenada se aproxima mediante interpolación lineal entre las mediciones anteriores y siguientes. (c) Histograma de los volúmenes de calibrador y CT medidos. (d) Gráfico de Bland-Altman (con eje x logarítmico) de los volúmenes tumorales de los dos métodos que muestra la dependencia del volumen del desacuerdo entre los dos métodos. (e) Diagrama de Venn de tumores medidos para tener exactamente volumen cero (no se detecta ningún tumor) mediante los dos métodos (de pares coincidentes que se muestran en a,b). (f) Curvas de crecimiento tumoral para un experimento, medidas con calibradores. Los tumores se trataron con 8 Gy × 3 XRT a los 8, 11 y 14 días después de la implantación. (g) Curvas de crecimiento para los mismos tumores que en el panel (f), medidas mediante segmentación automática por TC. Se incluyen datos de N = 35 ratones de un experimento para todos los paneles de esta figura y 25 adicionales de un segundo experimento se incluyen en los paneles (a-e).

Los mismos datos se muestran en la Fig. 3b, pero con líneas de conexión interpoladas linealmente entre puntos para cada mouse. Una observación importante sobre estos resultados es la gran cantidad de mediciones de calibre cercanas a 100 mm3 que corresponden a mediciones de TC cercanas a cero. A partir de histogramas superpuestos de estos volúmenes (Fig. 3c), vemos que el conjunto de datos se compone principalmente de tales mediciones. Un gráfico de Bland-Altman revela una fuerte dependencia del tamaño del desacuerdo entre los dos métodos (Fig. 3d). Ambos métodos informaron ocasionalmente volúmenes tumorales exactamente cero, aunque generalmente no para los mismos tumores (Fig. 3e).

Para investigar más a fondo las discrepancias entre los volúmenes tumorales medidos por calibradores y mediante segmentación automática de TC, ajustamos una función para predecir el volumen del calibrador a partir del volumen de TC para cada ratón (Fig. 4a) y utilizamos estos ajustes para hacer una regresión del efecto del tumor real. volumen en la medición del calibrador. Los volúmenes residuales medidos resultantes (Fig. 4b) tendieron a ser más altos algunos días que otros y, de hecho, se correlacionaron fuertemente con el volumen tumoral total promedio (Fig. 4c), lo que sugiere una tendencia a inflar los volúmenes informados de tumores pequeños cuando Hay tumores grandes.

La medición de tumores mediante segmentación de imágenes aclara las fuentes de error en los datos del calibrador. (a) Mediciones del volumen del tumor de un ratón representativo (verde) con ajuste cúbico (amarillo). (b) Residual de las mediciones del calibrador después de hacer una regresión del efecto del volumen real del tumor (líneas finas), trazado con el promedio de estos residuos de cada día (rojo) y el promedio de todas las mediciones del calibrador de cada día (azul-verde). ). (c) Diagrama de dispersión del residuo promedio (línea roja de b) versus el promedio de mediciones del calibre para el día (azul-verde de b). (d) Tasas de crecimiento calculadas restando mediciones consecutivas del volumen del tumor de la segmentación automática por TC. Estas son pendientes de las mismas curvas de crecimiento que se muestran en la figura 3g. (e) Tasas de crecimiento calculadas restando mediciones consecutivas del volumen del tumor del método del calibrador. Estas son pendientes de las mismas curvas de crecimiento que se muestran en la Fig. 3f. (f) Proyecciones de intensidad máxima de una exploración representativa con el tumor resaltado en cian. Las flechas se muestran en la dirección de los vectores propios con longitudes proporcionales a las raíces cuadradas de los valores propios correspondientes. La escala absoluta de las longitudes de las flechas es arbitraria y puede diferir ligeramente entre paneles. ( g ) Gráficos de dispersión de valores propios normalizados de la matriz de covarianza de las coordenadas de vóxel del tumor (en relación con el centroide) para los tumores de la Fig. 2 (rojo) y la Fig. 3 (azul-verde). Los códigos de color en la parte superior de cada panel indican la flecha correspondiente en (f). Los datos de N = 35 ratones incluidos son paneles (b – e). El panel (g) incluye 20 ratones adicionales, 18 de los cuales se muestran en las figuras 2b-d (2 fueron excluidos por el programa de análisis debido a problemas al segmentar una de las tres exploraciones).

En particular, el medidor tenía acceso directo a las mediciones de días anteriores al registrar cada nueva serie, como es práctica común. Esto reduce la probabilidad de informar mediciones claramente erróneas, pero significa que los datos no son verdaderamente independientes entre los puntos temporales. Es probable que las curvas de crecimiento tumoral (Fig. 3f) se suavicen para que parezcan más plausibles biológicamente debido a la influencia de mediciones anteriores. Una consecuencia no deseada de esto se puede observar en las tasas de crecimiento tumoral calculadas al comparar mediciones de volumen consecutivas de cada método (Fig. 4d, e). En este experimento, varios tumores se redujeron de forma espontánea e inesperada. El medidor del calibrador notó esto, pero se mostró abiertamente escéptico ante las tasas de crecimiento negativas, volvió a medir y finalmente registró menos reducciones y menos dramáticas en el volumen del tumor de lo que finalmente confirmaron los resultados de la segmentación automática.

Consideramos la tendencia a registrar mediciones consecutivas similares del mismo tumor como un posible contribuyente a la discrepancia observada entre las Figs. 2c y 3a (representados juntos en la figura complementaria S3A), pero optaron por investigar una explicación alternativa basada en diferencias en la forma del tumor. Los tumores medidos para la Fig. 2 se derivaron de la línea celular MOC2 y en su mayoría no fueron tratados, mientras que los tumores medidos para la Fig. 3 se derivaron de la línea celular P029 y se trataron con radioterapia. Por lo tanto, era plausible que las mediciones con calibrador tendieran a sobreestimar los volúmenes de los tumores MOC2 y subestimar los volúmenes de los tumores P029 debido a una diferencia en la forma. Para investigar esto, calculamos la descomposición propia de la matriz de covarianza de las coordenadas de cada vóxel del tumor en relación con su centroide (esencialmente análisis de componentes principales). Una interpretación geométrica conveniente de esto es que, para un tumor perfectamente elipsoidal, el volumen sería proporcional al producto de las raíces cuadradas de los valores propios. Para estos tumores, los dos valores propios más grandes corresponderían aproximadamente a las distancias medidas por los calibradores (Fig. 4e, f, Fig. Suplementaria S3B).

Para comparar las formas de los tumores entre los dos experimentos, "normalizamos" los valores propios tomando la raíz cuadrada y luego dividiéndolos por la suma de las raíces cuadradas (Fig. 4f, g). Los tumores MOC2 tendieron a ser más alargados que los tumores P029 de volúmenes similares, teniendo valores propios más grandes relativamente más pequeños y valores propios medios más grandes. Esto es consistente con los volúmenes de calibre más altos informados en la Fig. 2b, porque el valor propio medio corresponde aproximadamente a la distancia de calibre más corta (panel superior de la Fig. S3B complementaria), que se eleva al cuadrado en la ecuación. (1).

Nuestra hipótesis es que un beneficio principal de contar con datos más precisos sobre el volumen del tumor sería un análisis más fructífero de la dinámica del crecimiento del tumor. Las curvas de crecimiento de tres ratones se muestran en la Fig. 5a con representaciones 3D de los tumores correspondientes, que muestran los efectos nocivos de la forma del tumor en la medición del calibrador. En el primer ejemplo, el tumor era muy plano, lo que provocó que el medidor no lo detectara por completo (Fig. 5a, izquierda). El siguiente tumor tiene una forma típica y ejemplifica las fluctuaciones aparentemente aleatorias en el volumen del calibrador en los primeros momentos, seguidas de una tasa de crecimiento significativamente subestimada en momentos más grandes en los últimos momentos, observada en la mayoría de los ratones (Fig. 5a, centro). Finalmente, el tercer tumor no respondió tan completamente como la mayoría a la radioterapia, lo cual es evidente por el alto volumen de TC ya en el día 18, pero no por los datos del calibrador hasta el día 38 (Fig. 5a, derecha).

La segmentación automática por TC mejora el análisis de la curva de crecimiento. (a) Representaciones 3D de 3 tumores con diferentes formas (arriba) y curvas de crecimiento tumoral para estos tumores medidas tanto por TC como por calibrador. Las líneas de conexión son ajustes spline de segundo orden. (b) Modelo utilizado para ajustar las curvas de crecimiento tumoral para cada ratón. El coeficiente a representa el volumen del tumor en el momento de la RT, c representa el tiempo que tarda el tumor en reducirse después de la RT, d es el volumen máximo del tumor, f es la tasa de recrecimiento después de la RT y g está relacionado con el momento en que comienza el rebrote después de la RT. Los componentes gaussianos se muestran en rojo, los componentes logísticos se muestran en azul y una constante se representa en verde. La función celeste es la suma de estos componentes. (c) Se ajusta a las curvas de crecimiento tumoral de las mediciones de TC (izquierda) y de calibre (derecha) del mismo ratón representativo con componentes gaussianos y logísticos (punteados). (d) La comparación de los volúmenes medios medidos por CT y Caliper alrededor del momento de la XRT con el coeficiente g muestra una correlación negativa en las mediciones de CT, lo que sugiere una relación entre el volumen promedio del tumor en el momento de la RT y el tiempo de nuevo crecimiento del tumor después de la RT. (e) La comparación de los volúmenes medios medidos por CT y Caliper alrededor del momento de la XRT con el coeficiente f muestra una correlación negativa en las mediciones de CT, lo que sugiere una relación entre el volumen medio del tumor en el momento de la RT y la tasa de recrecimiento del tumor después de la RT. Las figuras (d) y (e) incluyen N = 43 ratones (todos los ratones de dos experimentos, excluidos los tumores que nunca volvieron a crecer).

Para demostrar la utilidad de curvas de crecimiento tumoral más precisas, desarrollamos un modelo simple para la dinámica de crecimiento de los tumores en estos experimentos, donde todos los tumores fueron tratados con radioterapia de rayos X (XRT):

Esto incluye una gaussiana para modelar el pico inicial alrededor del momento de XRT, una curva logística para modelar la fase de recrecimiento y un término constante para mejorar el ajuste al conjunto de datos del calibrador (Fig. 5b). Esto parece capturar las características más importantes de cada curva en una pequeña cantidad de parámetros fácilmente interpretables (Fig. 5c). Nuestra hipótesis es que los volúmenes tumorales durante y poco después del tiempo de XRT podrían predecir los parámetros f (la tasa fraccional de recrecimiento) y g (el tiempo de recrecimiento) que caracterizan la eventual fase de recrecimiento. En las curvas medidas por TC, encontramos que el volumen promedio entre 8 y 20 días después de la implantación del tumor se correlacionaba negativamente con f y g (Fig. 5d, e). Es posible que también estén presentes tendencias similares en los datos del calibrador, pero de manera menos clara. Las estadísticas de correlación se dan en la Tabla 1. Curiosamente, también existe una correlación negativa entre f y la esfericidad del tumor (Figura complementaria S4G) y a (volumen del tumor en el momento de la XRT) (Figura complementaria S5A), pero una correlación positiva. correlación entre c (tiempo para que el tumor se reduzca después de XRT) y g (Figura complementaria S5B). Tanto a como c contribuyen positivamente a los volúmenes tumorales promedio informados (Fig. 5d, e), sin embargo, la correlación entre cy g está en la dirección opuesta, lo que sugiere que los parámetros de ajuste gaussiano pueden separar dos efectos separados: tumores que se encogen lentamente después de la XRT también tardan más en entrar en la fase de nuevo crecimiento, y los tumores que crecen más rápido antes de la XRT vuelven a crecer más lentamente. También se observan correlaciones similares con las métricas de la forma del tumor en los primeros momentos (Figuras complementarias S4G, S5C, D). Estos hallazgos requieren validación y explicaciones que van más allá del alcance de este artículo, pero demuestran cómo una medición tumoral más precisa puede revelar efectos biológicamente interesantes que de otro modo pasarían desapercibidos.

Una característica notable de las curvas de crecimiento del calibre que se muestran en la Fig. 3f es que varias caen abruptamente de aproximadamente 100 mm3 a cero en el día 60, cuando se asumió que los ratones supervivientes se habían curado. Un ratón con un tumor cuyo volumen se mediría como 100 mm3 no es, de hecho, necesariamente distinguible de un ratón sin ningún tumor. En volúmenes pequeños, el tumor no es superficial sino en algún lugar del músculo de la mejilla, lo que hace que la medición con calibre no sea confiable. Además, las mediciones del calibrador de tumores pequeños tienden a fluctuar juntas durante el transcurso del experimento, lo que sugiere otra influencia humana contextual en las mediciones registradas (Fig. 3f, ampliada en la Fig. Suplementaria S3C). En cierto sentido, es racional informar las mediciones con información externa, ya que la presencia de tumores grandes puede predecir con mayor precisión cuándo los tumores pequeños comenzarán a volver a crecer que las observaciones de los tumores pequeños mismos. Sin embargo, esto es obviamente problemático desde la perspectiva del análisis de datos. El rango de volúmenes del calibrador informados para tumores cuyos volúmenes reales probablemente eran cercanos a cero (Fig. 4a) presenta una oportunidad para que el medidor sesgue sustancialmente el volumen promedio informado para un grupo de ratones, lo que podría confirmar falsamente una hipótesis incorrecta.

Curiosamente, los volúmenes del calibrador no se correlacionaron más fuertemente con los volúmenes de la aproximación elipsoide calculada a partir de los valores propios que con el volumen del recuento de vóxeles en general (Figura complementaria S4A), pero la correlación fue algo más fuerte para los tumores pequeños (Figura complementaria S4B). lo que sugiere que las mediciones del calibre informadas no estaban relacionadas con el tamaño del tumor en las dimensiones medidas, pero la falta de información sobre el grosor del tumor hace que la Ec. (1) una mala aproximación al volumen. Quizás esto no sea sorprendente, dado que esta fórmula común utiliza esencialmente la más corta de las dos medidas del calibre para aproximar el espesor, que no se mide directamente14. Los supuestos de la ecuación. (1) en la literatura se han propuesto explicaciones probables para la inexactitud de la medición del tumor mediante calibradores en comparación con la segmentación por TC8.

Si bien la aplicación del análisis de la forma del tumor presentada en la Fig. 4f, g es algo mundana, demuestra una fortaleza crítica de la medición del tumor mediante la segmentación de imágenes: en un experimento en el que algunos tumores fueron tratados o modificados genéticamente de una manera que afecta su forma, el calibrador las mediciones podrían detectar esto como una diferencia en el volumen del tumor o simplemente pasar por alto el efecto importante. Con exploraciones segmentadas de cada ratón, podemos probar nuevas hipótesis sobre la forma y ubicación del tumor post-hoc. Por ejemplo, la ubicación del tumor varía dentro de los experimentos (Figura complementaria S4C), al igual que la fracción de un tumor que podría caber dentro de una esfera del mismo volumen (Figura complementaria S4D), pero los tumores MOC2 y P029 muestran distribuciones similares en estos métricas (Figura complementaria S4E, F), lo que sugiere que el alargamiento de los tumores P029 puede no deberse a una mayor invasión en el cuello. La forma más complicada del tumor se ha asociado con peores resultados en pacientes con HNC15, al igual que el grosor del tumor y la proximidad a los vasos sanguíneos16, y la segmentación automatizada de imágenes podría contribuir significativamente a generar datos para determinar la importancia de la forma y ubicación del tumor en modelos de ratón.

En la clínica, la respuesta de los pacientes a la terapia a menudo se define radiográficamente basándose en cambios fraccionarios en el volumen del tumor. Aunque los Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos17 (RECIST), ampliamente utilizados, se basan en distancias medidas en imágenes médicas, a diferencia de los volúmenes de la segmentación de imágenes, se cree que la segmentación tiene un valor pronóstico superior18, pero a costa de un mayor tiempo del personal19. Vale la pena señalar que el volumen está lejos de ser el único aspecto importante de un tumor y puede que ni siquiera represente con precisión el número de células cancerosas en proliferación, ya que los tumores varían en celularidad20 y pueden contener regiones necróticas21. Sin embargo, es una cantidad mensurable y biológicamente importante, útil para comparar grupos de ratones con tumores que de otro modo probablemente serían similares. Las tomografías computarizadas segmentadas se utilizan ampliamente en física médica para simulaciones de Montecarlo para determinar la distribución espacial de la dosis de radiación. A pesar del acceso al equipo y al software para realizar estas simulaciones en ratones, normalmente no lo hacemos, porque el tiempo de planificación del tratamiento limita la cantidad de ratones que se pueden tratar. Automatizar la segmentación podría mejorar significativamente esta situación, permitiendo una administración de radiación más precisa y adaptada a la geometría específica de cada tumor.

Dado que la mayoría de los ensayos clínicos no logran impactar los resultados de los pacientes22, el valor traslacional de los modelos preclínicos para enfermedades humanas se cuestiona cada vez más. Particularmente en el cáncer de cabeza y cuello, donde los ensayos de inmunoterapia y terapia dirigida han fracasado uniformemente23, existe la necesidad de realizar investigaciones preclínicas para predecir mejor los efectos de los fármacos en pacientes humanos, lo que podría abordarse en parte aumentando la calidad y cantidad de datos obtenidos de cada ratón. A ello contribuye el método de medición de tumores bucales aquí descrito, así como la detección de metástasis pulmonares, para lo cual también se utilizaron las mismas exploraciones. El software para la segmentación automática de tumores de pulmón en imágenes de TC se ha descrito muchas veces en la literatura3,24,25,26,27, y una dirección futura prometedora podría ser integrar la medición automática de metástasis pulmonares en nuestro software para reducir aún más el tiempo de análisis de imágenes. .

La automatización de la medición de tumores no solo mejora la precisión y la confiabilidad, sino también la reproducibilidad de los resultados. Los intentos de replicar experimentos preclínicos de biología del cáncer a menudo se ven socavados por una descripción inadecuada de los métodos y encuentran tamaños de efecto más pequeños que los publicados originalmente en la gran mayoría de los casos28, lo que apunta a problemas generalizados en este campo. Las imágenes CBCT de animales pequeños están disponibles en muchas universidades, ya sea para radioterapia guiada por imágenes o en máquinas de micro-CT independientes. Automatizar el análisis de imágenes CBCT no sólo podría fomentar un uso más amplio de esta tecnología, sino también estandarizar la cuantificación para comparaciones absolutas del crecimiento tumoral entre experimentos realizados en diferentes instituciones. Esto tiene el potencial de reducir el costo en vidas animales de los experimentos oncológicos preclínicos, al tiempo que mejora su valor traslacional a la medicina.

Desafortunadamente, existen obstáculos importantes que impiden el uso generalizado de imágenes CBCT para monitorear el crecimiento tumoral en ratones. Requiere acceso a una máquina de imágenes adecuada, probablemente durante muchas horas en el transcurso de un experimento, lo que será imposible o prohibitivamente costoso para muchos investigadores, incluso utilizando análisis automatizados de escaneos con múltiples ratones. Además, nuestro software no es perfecto y solo tiene funciones necesarias para la configuración de imágenes y los experimentos específicos para los que lo diseñamos, lo que significa que probablemente sería necesario escribir código adicional para poder usarlo en otras instituciones. Si bien el método de segmentación descrito aquí solo puede usarse para medir tumores que crecen en un lado de la cabeza o el cuello, es notable que el método de escaneo y gran parte del código también serían aplicables a la medición de tumores de pulmón y flancos y quizás otros. Lugares donde los tumores pueden identificarse fácilmente en imágenes de TC. Una extensión más simple del código existente podría consistir esencialmente en registrar la imagen de cada ratón con un escaneo diferente en lugar de su imagen especular para eliminar la necesidad de que los tumores se limiten a un lado de la cabeza.

Una limitación notable de este estudio es la falta de un método estándar de evaluación del volumen para determinar la precisión absoluta del método. Una solución aparentemente razonable a este problema sería diseccionar el tumor cuando se sacrifica a cada ratón y medir su volumen real mediante desplazamiento de líquido o pesarlo para calcular el volumen a partir de su densidad esperada. Desafortunadamente, esto no parecía ser una opción viable para los experimentos presentados aquí, porque los tumores invadieron ampliamente el tejido normal adyacente y cuando los ratones fueron sacrificados y completados, la extirpación precisa del tumor sin tejido normal puede no ser factible. En ausencia de este tipo de datos no podemos informar con confianza sobre la precisión absoluta del método.

Otra limitación del manuscrito actual es el pequeño número de modelos tumorales examinados. Diferentes sitios de implantación, líneas celulares y tratamientos pueden dar resultados algo diferentes. Nuestros hallazgos serían aplicables a una gama más amplia de experimentos de oncología preclínica si hubiéramos desarrollado un método automatizado para medir los tumores del flanco, utilizado para estudiar muchos tipos de cáncer. Sin embargo, es probable que el método del calibrador sea más preciso para medir tumores en el flanco que el bucal, porque es menos probable que el tumor quede oculto por el tejido normal. En particular, las serias limitaciones del método del calibrador para medir los tumores bucales de ratones eran obvias antes de que se recopilaran estos datos, simplemente porque a menudo es difícil decidir dónde colocar los calibradores o si hay un tumor presente. Este no es necesariamente el caso de tumores en otras ubicaciones y estos resultados no deben aplicarse a las mediciones con calibre en general.

Nuestro software probablemente también podría mejorarse para brindar resultados más precisos con un mayor desarrollo de varios módulos. Por ejemplo, no incorporamos ninguna información sobre la anatomía de los tejidos blandos, que podría usarse para hacer mejores estimaciones de la profundidad del tumor o localizar con mayor precisión la línea media cuando se dobla el cuello. La precisión de nuestras segmentaciones tumorales también está inevitablemente limitada por la modalidad de imagen. Se utilizaron exploraciones CBCT de bastante baja calidad para facilitar la obtención de imágenes rápidamente de un gran número de ratones, pero la resonancia magnética de alta resolución o agentes de contraste podrían, en principio, usarse para generar segmentaciones más precisas incorporando información del contraste de los tejidos blandos.

A pesar de estos desafíos técnicos, nuestro software tiene varias aplicaciones prácticas claras para experimentos preclínicos de HNC. Una es aleatorizar los grupos después de la implantación pero antes del tratamiento para garantizar distribuciones de volumen tumoral inicialmente similares. Otra es calcular los cambios en el volumen del tumor; Podría ser útil comparar los cambios relativos en el volumen del tumor desde el inicio del tratamiento, pero esto claramente no sería apropiado para los datos que se muestran en la Fig. 3f, porque los volúmenes de la medición con el calibrador en el momento de la XRT eran irrealmente altos y parecen ser muy débilmente correlacionado con los volúmenes reales de los tumores. La monitorización de tumores mediante segmentación automatizada de imágenes abre la puerta a análisis más sofisticados del crecimiento tumoral, como comparaciones de formas y ajuste de modelos matemáticos, y tiene un gran potencial para impactar positivamente la forma en que se realizan los experimentos preclínicos de HNC.

Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado (IACUC). Algunos ratones fueron sacrificados debido a volúmenes tumorales superiores a 1000 mm3 o pérdida de peso superior al 5% del peso corporal por día durante 2 a 3 días, o respiración anormal debido a metástasis pulmonares. Otros fueron sacrificados sin alcanzar estos criterios de valoración debido a la ulceración del tumor. El método de eutanasia empleado fue la inhalación de dióxido de carbono seguida de dislocación cervical, de acuerdo con las pautas de la Asociación Estadounidense de Medicina Veterinaria para la eutanasia de animales. Todos los experimentos se informan de acuerdo con las pautas de ARRIVE29.

Las imágenes analizadas para este manuscrito se recopilaron para experimentos diseñados para explorar las funciones de la señalización de ephrinB2/EphB4 en el cáncer de cabeza y cuello. Sin embargo, los efectos de estas proteínas sobre el crecimiento tumoral están fuera del alcance de este manuscrito, por lo que los datos agrupados de múltiples afecciones se presentan sin identificación. Todos los análisis incluyen todos los ratones del experimento o experimentos presentados. Ratones C57BL/6 de tipo salvaje o EfnB2fl/flTie2-Cre-ERT (C57BL/6 genéticamente modificado) implantados con 100.000 células MOC230 o 50.000 P02931 en la boca derecha. Todos los ratones tenían aproximadamente 3 meses de edad en el momento de la implantación del tumor y eran hembras, excepto los datos de 25 machos incluidos en las Figs. 3a–e y 5d,e. La línea celular MOC2 se obtuvo del Dr. Ravindra Uppaluri (Instituto del Cáncer Dana-Farber, Boston, MA)32, la línea celular P029 del laboratorio Xiao-Jing Wang (Universidad de Colorado, Campus Médico Anschutz). Las manipulaciones genéticas (para eliminar/eliminar EphB4) de las líneas celulares MOC2 y P029 fueron realizadas por el Centro de Genómica Funcional del Centro de Cáncer de la Universidad de Colorado. Las células MOC2 se transfectaron con plásmido de control PX458 o PX458 que contenía ARNg dirigido a EPHB4 y desactivación CRISPR (las mismas células se usaron en Bhatia, et al., 2022)32. Las células P029 se transdujeron con shRNA dirigido a EphB4 murino o shRNA no específico. Algunos ratones también fueron tratados con plásmidos TNYL-RAW-Fc (inhibidor de EphB4) o PCDNA3 (control), como en Bhatia et al.33, excepto que se administraron dos dosis de plásmido antes de la implantación del tumor. El procedimiento para la implantación de tumores bucales se describió previamente en Oweida et al.14. Todos los tumores se trataron con 8 Gy × 3 XRT a los 8, 11 y 14 días después de la implantación, excepto que se indique lo contrario.

El programa comienza ubicando los dientes, que se identificaron fácilmente debido a su alta densidad, y definiendo etiquetas y puntos para los dientes frontales, inferiores y posteriores, que pueden identificarse de manera confiable en casi todas las exploraciones (Figura complementaria S2C). Utilizando esto como punto de partida, el hueso se segmentó de manera similar para identificar estructuras como la mandíbula, el cráneo y los hombros (Fig. 1e). Luego, un conjunto de segmentos de línea que conectan puntos en la línea media y los puntos correspondientes en los lados izquierdo y derecho del esqueleto en el escaneo original se asignaron a segmentos de línea de una estructura que puede doblarse en las intersecciones para adaptarse a la posición del mouse y al mismo tiempo preservar la longitudes de los segmentos de línea (Figura complementaria S2D). Se calcula una cuadrícula de remuestreo local para rotar y traducir parte del escaneo de origen a la orientación que se muestra en la Fig. 1f para cada segmento de línea, luego estos se unen para formar una única cuadrícula de remuestreo curvilínea. La figura complementaria S3E muestra cortes centrales de un patrón de tablero de ajedrez tridimensional remuestreado de la misma manera para demostrar cómo se deformó la imagen original.

Debido a que los vóxeles del escaneo remuestreado pueden representar volúmenes de espacio real ligeramente desiguales, fue necesario calcular estos volúmenes. La figura complementaria S2F muestra el mapa del volumen máximo representado por un vóxel a lo largo de tres direcciones a través de la cuadrícula de remuestreo inicial. Las áreas rojas de estas imágenes muestran que los hombros se comprimieron para abarcar una distancia estandarizada. Luego, la cuadrícula de muestreo se ajusta mediante descenso de gradiente, registrando la cabeza con su propia imagen especular con una precisión de subpíxeles utilizando una función de pérdida que también penaliza la curvatura, pero expande o comprime ligeramente algunos vóxeles (Figura complementaria S2G). Para garantizar que todo el espacio real se contara exactamente una vez, el volumen representado por cada vóxel de la imagen remuestreada se calculó a partir de volúmenes de una disposición flexible que llena el espacio de 24 tetraedros por vóxel (Figura complementaria S2B).

Una vez que se obtuvieron los escaneos, se procesaron para garantizar que la medición de la cabeza no fuera superada por otros objetos en el escaneo. Para escaneos con tres y cinco mouse, se estableció un sistema de coordenadas para un análisis consistente (Figura complementaria S2A). El procesamiento de los escaneos exportados generó una serie de escaneos con un solo mouse.

Para escaneos de origen que contienen hasta tres ratones en una sola fila en el plano XY, la división del escaneo comienza encontrando la plataforma acrílica tomando primero la media de 100 columnas de vóxeles espaciadas uniformemente para determinar dónde no descansaban los ratones en la cama. A lo largo de estas columnas, el "punto de base" se identifica como el valor z donde se observa y anota la mayor diferencia en la intensidad del vóxel en combinación con los valores x e y asociados. A partir de estos puntos, se calculó un plano y a los vóxeles en el área debajo del avión se les asignó el mismo valor de intensidad que el aire, eliminándolo efectivamente del escaneo. A continuación, se utilizaron dos métodos redundantes para separar horizontalmente a los ratones en la exploración. Primero, se tomó la intensidad media del vóxel de cada plano YZ (sagital) para generar una señal unidimensional que tiende a tener valores bajos en los espacios entre ratones. A continuación, se aplicó un umbral para aislar los vóxeles correspondientes a los dientes y se calculó una segunda señal unidimensional sumando el número de vóxeles de densidad dental correspondientes a cada ratón. Luego se calcula un conjunto de ubicaciones de división suavizando la primera señal y encontrando mínimos locales. Si el número de mínimos identificados es consistente con el número esperado de ratones en el escaneo, estos se convierten en los puntos de división finales. De lo contrario, la segunda señal se suaviza de manera similar y sus máximos locales se toman como centros de los ratones para calcular los puntos de división mediante un método alternativo.

Para los escaneos con cinco ratones, los puntos de división se ubicaron primero a lo largo del eje z para la división vertical antes de la división horizontal de las filas media e inferior. Las alturas de las camas se estimaron utilizando el mismo método que los tres escaneos con ratón. Sin embargo, se encontraron tres rangos de altura diferentes para cada una de las tres plataformas, lo que permitió clasificarlas en puntos de plataforma inferior, medio y superior. Estos se utilizaron para determinar la ubicación de cada plataforma. La búsqueda de dientes en los escaneos con cinco ratones también difería de la de los escaneos con tres ratones. La intensidad máxima del vóxel de los cortes XY se obtuvo a lo largo del eje z, encontrando las alturas de cada fila de ratones para dividir el escaneo en el eje z. A lo largo del eje z, los ratones se dividieron justo debajo del punto máximo de los dientes en cada fila de ratones o justo encima de la plataforma que soportaba la fila de ratones. A lo largo del eje x, las dos filas inferiores se dividieron en el medio del escaneo, debido a la consistencia del escaneo de volumen y la amplia distancia entre los dos ratones en estas filas (Fig. 1c).

Una vez que se dividieron los escaneos, se procesaron más para eliminar objetos no deseados en cada escaneo (Fig. 1d). Luego se sumó la suma de los vóxeles de densidad del tejido en cada exploración para determinar si había un ratón presente en la exploración dividida. Si el escaneo estaba vacío, no se procesó más. El paquete Python Connected Components 3D se utilizó para identificar y eliminar objetos no deseados, como extremidades de ratones adyacentes, que a veces están presentes en el escaneo con un solo mouse después de la división. Este método también se utilizó para retirar el cono nasal de anestesia. Los escaneos con un mouse que se originaron a partir de escaneos con cinco mouse requirieron un procesamiento adicional para eliminar los lados de los soportes del mouse. Esto se hizo ajustando un plano a los puntos que se encuentran en los lados de plástico sobre el ratón en cada escaneo, en un proceso similar al de quitar la cama. Luego, la exploración aislada de cada ratón se ajustó automáticamente en función del histograma de los valores de vóxel para garantizar que valores numéricamente similares correspondan al aire y al tejido blando antes de realizar más análisis.

Todo el código se escribió en Python, utilizando principalmente los paquetes informáticos científicos estándar NumPy, SciPy, Pandas y Matplotlib, así como NiBabel y Pydicom para leer y escribir archivos de imágenes, y Connected Components 3D para analizar componentes conectados de imágenes binarias. La arquitectura general del programa se describe a continuación y en la figura complementaria S6.

Los escaneos CBCT se procesaron utilizando una serie de módulos escritos en Python, que integran una hoja de cálculo de Microsoft Excel que contiene información y ubicaciones de escaneo como interfaz de usuario. Opcionalmente, estos módulos pueden devolver escaneos individuales con un solo mouse, escaneos alineados solo de la cabeza, segmentación de estructuras, incluido el tumor, registro de errores o advertencias de procesamiento, números de identificación del mouse, volúmenes de tumores, fechas, ubicaciones de los archivos fuente y generados, y depuración. información.

El código se dividió en 7 módulos. Dos de ellos proporcionaron la base necesaria para trabajar con tomografías computarizadas. El primero de ellos, "voxelhelp", contenía varias funciones diseñadas para ayudar con el procesamiento y visualización generales de imágenes en 3D. El siguiente, "xradct", definió clases específicas para escaneos de uno, tres y cinco mouse obtenidos utilizando XRAD SmART y objetos de anotación y segmentación para crear una mayor facilidad de uso para este tipo de escaneos.

Los dos módulos siguientes realizaron la mayor parte del procesamiento de cada exploración para separar cada ratón en la exploración y calcular el volumen del tumor. El módulo "scan_processing" dividió escaneos sin procesar de tres y cinco mouse para producir imágenes limpias de un mouse con los componentes del soporte del mouse y la configuración de anestesia eliminados, que fueron utilizados por el módulo "head_segmentation" para localizar características anatómicas y segmentar el imagen.

Los tres últimos módulos sirvieron para la organización y contención de los cuatro anteriores. El módulo "task_controller" utilizó la información de escaneo de la hoja de cálculo de entrada para dividir cada escaneo y segmentar los nuevos escaneos divididos. El módulo "ejecutar" proporcionó una interfaz más limpia para ejecutar el código. Finalmente, un módulo adicional llamado "process_pool_controller" puede actuar como un contenedor para "task_controller", permitiendo la ejecución multiproceso para que se puedan analizar muchos escaneos simultáneamente o proporcionar una interfaz alternativa a los otros módulos.

El irradiador XRAD-SmART está equipado para escanear un volumen cilíndrico de hasta aproximadamente 10 cm × 10 cm. Utilizamos estas capacidades para realizar un seguimiento longitudinal del crecimiento del tumor y obtener datos cualitativos sobre el tamaño del tumor. Los ratones se anestesiaron con una concentración de isoflurano del 1 al 2% y se colocaron en el XRAD-SmART en posición boca abajo con una pequeña nariz en la máquina para permanecer bajo anestesia. Para obtener imágenes de tumores bucales, las extremidades delanteras normalmente se desplazaban hacia atrás detrás de los hombros, para evitar posibles problemas con la segmentación de la imagen (Fig. 1b, Fig. Suplementaria S1D). En algunos casos, se realizó una breve fluoroscopia para garantizar la colocación correcta de todos los ratones en el volumen escaneable, seguida de una exploración CBCT preliminar de baja resolución para seleccionar el volumen que se reconstruirá para imágenes posteriores. Las exploraciones CBCT se adquirieron utilizando ajustes preestablecidos de exploración de dosis alta (vóxeles de 0,1 mm) o de dosis baja (vóxeles de 0,2 mm) con rayos X de 80 kVp o 60 kVp filtrados a través de 0,8 mm de berilio y 2 mm de aluminio. Luego se sacó cada ratón de la máquina y se volvió a colocar en su jaula para recuperarlo mientras la computadora terminaba de reconstruir la imagen. Los escaneos se exportaron desde el software Pilot XRAD 1.18.3 como archivos DICOM para su análisis. Para obtener imágenes con contraste (Fig. 2e, f), se inyectaron 200 µL de iohexol en la vena de la cola 15 minutos antes de la obtención de imágenes con rayos X de 80 kVp y un espaciado de vóxeles de 0,1 mm. Todas las exploraciones que no se utilizaron para la segmentación manual de tumores se adquirieron sin agente de contraste.

Para permitir la obtención de imágenes simultáneas de tres ratones a la vez, modificamos el sistema de anestesia en el irradiador dividiendo el tubo de isoflurano en varios más pequeños y los unimos a una amplia plataforma acrílica (Figura complementaria S1D). Sin embargo, dado que cada jaula de nuestro vivero puede albergar hasta cinco ratones, razonamos que escanear cinco ratones a la vez aumentaría significativamente la eficiencia para estudios más grandes, ya que esto permite escanear cada jaula individualmente. Para realizar estas exploraciones, diseñamos un dispositivo para sostener y anestesiar a cinco ratones. Un marco impreso en 3D contiene pequeños trozos de plástico en forma de tres ranuras de medio pentágono para tres ratones. Luego, este conjunto se suspende sobre dos ratones más debajo de objetos impresos en 3D adicionales pegados a la plataforma acrílica. El soporte para cinco ratones fue diseñado para encajar dentro del diámetro de 10 cm del volumen de escaneo cilíndrico y sostener los cinco ratones aproximadamente a la misma distancia del eje de rotación del pórtico, lo cual es importante porque la calidad de la imagen varía con esta distancia. Los ratones primero se anestesiaron en la cámara de inducción, luego los dos inferiores se colocaron boca abajo con la nariz hacia los tubos de anestesia. El nivel superior del dispositivo se coloca sobre los dos ratones inferiores y los ratones restantes se colocan en los tres soportes superiores en la misma posición que los dos inferiores. Los ratones se escanearon utilizando el ajuste preestablecido de resolución más baja para disminuir el tiempo de procesamiento del escaneo.

Las exploraciones CBCT se cronometraron utilizando una combinación de datos de cronómetro y marcas de tiempo asociadas con el comienzo de cada exploración. Las mediciones con calibre se cronometraron utilizando un cronómetro. Se encontró que los tiempos asociados con la configuración de cualquiera de los métodos de medición eran similares, pero variaban lo suficiente como para omitirlos de los datos de tiempo total.

Las curvas de crecimiento que se muestran en la Fig. 5a se generaron ajustando splines de segundo orden usando scipy.interpolate.UnivariateSpline. Para mitigar los posibles efectos de la recopilación de datos de calibrador y TC en diferentes días, también utilizamos estas splines para volver a muestrear las curvas de crecimiento en 10 puntos entre 8 y 20 días después de la implantación, y promediamos estos valores para obtener los volúmenes de tumor informados en la Fig. 5d. . Ajuste de la ecuación. (2) El volumen de datos se realizó utilizando scipy.linalg.lstsq().

Todos los coeficientes de correlación se calcularon utilizando las funciones SciPy scipy.stats.pearsonr() y scipy.stats.spearmanr(). Las pruebas ANOVA unidireccionales que comparan los volúmenes del calibrador para todos los grupos dentro de cada experimento en cada día cuando los datos del calibrador estaban disponibles para todos los ratones se realizaron utilizando la función scipy.stats.f_oneway(). El valor p para cada prueba fue> 0,05, excepto el experimento que se muestra en la Fig. 3f, g, que tuvo un valor p ANOVA de 0,04 yf = 2,85 a los 23 días después de la implantación. Esto se confirmó utilizando GraphPad Prism, pero una prueba de seguimiento de Sidak que comparó cada par de grupos que diferían exactamente en una forma no encontró diferencias estadísticamente significativas entre los grupos individuales. El ajuste de los valores p de ANOVA para comparaciones en varios días tampoco produce diferencias estadísticamente significativas. .

El código de análisis de imágenes estará disponible en GitHub. Los datos del volumen del tumor se incluyen en los archivos Excel complementarios S1 a S4. Las exploraciones CBCT están disponibles a pedido del autor correspondiente.

Jubelin, C. y col. Modelos tridimensionales de cultivo in vitro en investigación oncológica. Biociencia celular. 12, 155 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, X. y col. Tumor en un chip: del diseño bioinspirado a la aplicación biomédica. Microsistema. Nanoeng. 7, 50 (2021).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holbrook, MD y cols. Detección de nódulos pulmonares en imágenes de micro-CT mediante aprendizaje profundo. Tomografía 7, 358–372 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmidt, KF y cols. Las técnicas de reconstrucción de volumen mejoran la correlación entre las mediciones histológicas e in vivo del volumen del tumor en modelos de ratón de gliomas humanos. J. Neurooncol. 68, 207–215 (2004).

Artículo PubMed Google Scholar

Kirsch, DG y cols. Imágenes de cánceres de pulmón primarios en ratones para estudiar la biología de la radiación. En t. J. Radiat. Oncol. Biol. Física. 76, 973–977 (2010).

Montelius, M., Ljungberg, M., Horn, M. y Forssell-Aronsson, E. Medición del tamaño del tumor en un modelo de ratón mediante resonancia magnética de alta resolución. BMC Med. Imágenes 12, 1–7 (2012).

Artículo de Google Scholar

Brodin, NP y cols. La segmentación semiautomática por TC de haz cónico de tumores subcutáneos preclínicos in vivo proporciona una alternativa no invasiva eficaz para las mediciones del volumen del tumor. Hno. J. Radiol. 88, 20140776 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jensen, MM, Jørgensen, JT, Binderup, T. & Kjær, A. El volumen tumoral en xenoinjertos subcutáneos de ratón medido por microCT es más preciso y reproducible que el determinado por 18F-FDG-microPET o un calibrador externo. BMC Med. Imágenes 8, 1–9 (2008).

Artículo de Google Scholar

Bausart, M. y col. Desajuste entre las imágenes de bioluminiscencia (BLI) y la resonancia magnética al evaluar el crecimiento del glioblastoma: lecciones de un estudio en el que BLI sugirió "regresión" mientras que la resonancia magnética mostró progresión. Cánceres 15, 1919 (2023).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baklaushev, V. et al. La expresión de luciferasa permite obtener imágenes de bioluminiscencia, pero impone limitaciones al modelo de cáncer de mama en ratón ortotópico (4T1). Ciencia. Rep. 7, 7715 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

O'Neill, K., Lyons, SK, Gallagher, WM, Curran, KM y Byrne, AT Imágenes bioluminiscentes: una herramienta fundamental en la investigación oncológica preclínica. J. Pathol. Soc. Gran hermano. Irlanda 220, 317–327 (2010).

CAS Google Académico

Holman, L., Head, ML, Lanfear, R. y Jennions, MD Evidencia de sesgo experimental en las ciencias biológicas: por qué necesitamos el registro de datos ciego. PLoS Biol. 13, e1002190 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Macleod, MR y cols. La evidencia de la eficacia de NXY-059 en la isquemia cerebral focal experimental se ve confundida por la calidad de los estudios. Accidente cerebrovascular 39, 2824–2829 (2008).

Artículo PubMed Google Scholar

Oweida, AJ, Bhatia, S., Darragh, L., Serkova, N. y Karam, SD Inoculación intramucosa de células de carcinoma de células escamosas en ratones para el perfil inmunológico del tumor y la evaluación de la respuesta al tratamiento. JoVE (J. Vis. Exp.), e59195 (2019).

Majdoub, M. y col. Valor pronóstico de la esfericidad proliferativa de tumores de cabeza y cuello a partir de la tomografía por emisión de positrones con 3'-desoxi-3'-[18 F] fluorotimidina. Traducción IEEE. Radiación. Medicina de plasma. Ciencia. 2, 33–40 (2017).

Artículo de Google Scholar

Pentenero, M., Gandolfo, S. & Carrozzo, M. Importancia del grosor del tumor y la profundidad de la invasión en la afectación ganglionar y el pronóstico del carcinoma oral de células escamosas: una revisión de la literatura. Cabeza Cuello J. Sci. Especificaciones. Cabeza Cuello 27, 1080–1091 (2005).

Artículo de Google Scholar

Eisenhauer, EA y cols. Nuevos criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos: guía RECIST revisada (versión 1.1). EUR. J. Cáncer 45, 228–247 (2009).

Bradley, JD y cols. Volumen tumoral bruto, factor pronóstico crítico en pacientes tratados con radioterapia conformada tridimensional para el carcinoma de pulmón de células no pequeñas. En t. J. Radiat. Oncol. Biol. Física. 52, 49–57 (2002).

Fenerty, KE, Patronas, NJ, Heery, CR, Gulley, JL & Folio, LR Recursos necesarios para mediciones volumétricas semiautomáticas en cordoma metastásico: ¿Vale la pena dedicar tiempo a la evaluación de la carga tumoral potencialmente mejorada? J. Dígito. Imágenes 29, 357–364 (2016).

Artículo PubMed Google Scholar

Lin, S. y col. Cuantificación digital de la celularidad tumoral como una nueva característica pronóstica del carcinoma de pulmón de células no pequeñas. Modificación. Patol. 36, 100055 (2023).

Artículo PubMed Google Scholar

Cui, S. Formación de núcleos necróticos en el crecimiento de tumores: resultados analíticos. Acta Matemáticas. Ciencia. 26, 781–796 (2006).

Artículo MathSciNet MATEMÁTICAS Google Scholar

Seyhan, AA Perdido en la traducción: El valle de la muerte a través de la división preclínica y clínica: identificación de problemas y superación de obstáculos. Traducción Medicina. Comunitario. 4, 1-19 (2019).

Artículo de Google Scholar

Hayes, DN, Gleysteen, JP y Schwartz, DL vol. 40 1967–1970 (Wolters Kluwer Health, 2022).

Montgomery, MK y cols. Herramienta de segmentación automatizada de pulmones de ratón para cuantificar tumores de pulmón después de una tomografía microcomputarizada. MÁS UNO 16, e0252950 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van de Worp, WR et al. Segmentación automatizada de tumores de pulmón ortotópicos basada en aprendizaje profundo en tomografías computarizadas de ratón de cuerpo entero. Cánceres 13, 4585 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Namati, E. et al. Evaluación longitudinal de la progresión del cáncer de pulmón en ratones mediante imágenes de micro-CT in vivo. Medicina. Física. 37, 4793–4805 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Barck, KH y cols. Cuantificación de la carga tumoral en un modelo de cáncer de pulmón en ratones modificado genéticamente mediante micro-CT y análisis automatizado. Traducción Oncol. 8, 126-135 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Errington, TM y cols. Investigando la replicabilidad de la biología preclínica del cáncer. Elife 10, e71601 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Percie du Sert, N. et al. Las directrices ARRIVE 2.0: Directrices actualizadas para informar sobre investigaciones con animales. J. Cereb. Metabolismo del flujo sanguíneo. 40, 1769-1777 (2020).

Judd, NP y cols. La regulación ERK1/2 de CD44 modula la agresividad del cáncer oral. Res. Cáncer. 72, 365–374. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-11-1831 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Alemán, J., Nguyen, KA, Ke, Y., Young, CD y Wang, XJ en Actas: Reunión anual de la AACR 2022. (Asociación Estadounidense para la Investigación del Cáncer).

Bhatia, S. y col. EphB4 y ephrinB2 actúan en oposición en el microambiente del tumor de cabeza y cuello. Nat. Comunitario. 13, 3535. https://doi.org/10.1038/s41467-022-31124-7 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bhatia, S. y col. La inhibición de la señalización de EphB4-Ephrin-B2 reprograma el microambiente inmunológico del tumor en los cánceres de cabeza y cuello. Cáncer Res 79, 2722–2735. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-3257 (2019).

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BN dibujó la Figura 1b y la Figura complementaria S1D para este manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial para SDK (subvenciones n.º 1R01DE028282-01, 1R01DE028529-01), mediante la subvención n.º. 1P50CA261605-01 (SDK) y el NCI (R01 CA284651-01).

Departamento de Oncología Radioterápica, Universidad de Colorado, Campus Médico Anschutz, Aurora, EE. UU.

Benjamin Van Court, Brooke Neupert, Diemmy Nguyen, Richard Ross, Michael W. Knitz y Sana D. Karam

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Conceptualización: BVC, BN, SDK Metodología: BVC, BN Software: BVC, BN Investigación: DN, BN, BVC, MWK Visualización: BVC, BN Supervisión: SDK Redacción—borrador original: BVC, BN Redacción—revisión y edición: BVC, SDK, RR

Correspondencia a Sana D. Karam.

El Dr. Karam recibe financiación clínica de Genentech, Ionis y AstraZeneca y financiación preclínica de Roche para trabajos no relacionados con este manuscrito. Todos los demás autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Van Court, B., Neupert, B., Nguyen, D. et al. Medición de tumores de cabeza y cuello de ratón mediante análisis automatizado de imágenes CBCT. Representante científico 13, 12033 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39159-6

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Recibido: 28 de abril de 2023

Aceptado: 20 de julio de 2023

Publicado: 25 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39159-6

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