Las adaptaciones coordinadas definen el cambio ontogenético del gusano

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 3287 (2023) Citar este artículo

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Los caracoles cónicos marinos han atraído a investigadores de todas las disciplinas, pero las primeras etapas de su vida han recibido una atención limitada debido a las dificultades para acceder o criar especímenes juveniles. Aquí, documentamos el cultivo de Conus magus desde los huevos hasta la metamorfosis para revelar cambios dramáticos en el comportamiento alimentario depredador entre especímenes juveniles postmetamórficos y adultos. Los adultos de C. magus capturan peces utilizando un conjunto de péptidos venenosos paralizantes combinados con un diente radiular en forma de gancho que se utiliza para atar a los peces envenenados. Por el contrario, los primeros juveniles se alimentan exclusivamente de gusanos poliquetos utilizando un comportamiento de búsqueda de alimento único de "picadura y acecho" facilitado por dientes radulares cortos y sin púas y un repertorio de veneno distintivo que induce hipoactividad en la presa. Nuestros resultados demuestran cómo los cambios morfológicos, conductuales y moleculares coordinados facilitan el cambio de la caza de gusanos a la caza de peces en C. magus, y muestran a los caracoles cono juveniles como una fuente rica e inexplorada de nuevos péptidos venenosos para estudios ecológicos, evolutivos y de biodescubrimiento.

A lo largo de la historia de la vida, las innovaciones evolutivas han permitido que los linajes en evolución adquieran nuevas funciones que abren oportunidades ecológicas y, en muchos casos, promueven la diversificación1,2. Comprender cómo se han producido estas transiciones puede ser un desafío, ya que los rasgos observados a menudo surgen de una serie de cambios evolutivos que eventualmente culminan en un rasgo complejo3,4. El aparato venenoso de los caracoles cono marinos (Gastropoda: Conidae) es un ejemplo de innovación evolutiva que evolucionó a través de modificaciones morfológicas del intestino anterior5, promoviendo la extensa radiación del grupo desde el Eoceno, con más de 1000 especies existentes distribuidas en todo el mundo6. Este grupo de gasterópodos depredadores ha evolucionado dentro de un ciclo de vida bifásico, en el que la mayoría de las especies eclosionan como larvas que nadan libremente y se convierten en juveniles carnívoros bentónicos después de la metamorfosis7,8. La alimentación depredadora después de la metamorfosis se basa en el despliegue de potentes neurotoxinas (conotoxinas) secretadas en una glándula venenosa tubular larga e inyectadas a través de dientes radiulares huecos y altamente modificados9,10. Esta sofisticada estrategia de alimentación ha permitido a estos depredadores de lento movimiento alimentarse inicialmente de gusanos y, más recientemente, facilitó el cambio evolutivo hacia la caza de moluscos y peces11,12.

Debido a su reciente y extensa radiación y a la gran cantidad de péptidos venenosos que producen, los caracoles cono han atraído el interés de biólogos evolutivos11, farmacólogos13 y toxicólogos14, pero este amplio interés contrasta con la escasez de literatura sobre las primeras etapas de la vida. Las observaciones de juveniles en el campo se han visto obstaculizadas por su tamaño diminuto y su identificación a menudo limitada por la alta similitud morfológica entre especies relacionadas15,16,17. Por otro lado, los desafíos en la cría de caracoles cono han restringido investigaciones previas a la exploración de etapas embrionarias y larvarias18,19,20,21. Debido a estas limitaciones, la ecología y la bioquímica de los caracoles cono juveniles se han pasado por alto en gran medida. Esto se extiende a especies ampliamente estudiadas como el cono del mago (Conus magus Linnaeus, 1758), la fuente del analgésico Prialt® (ω-conotoxina MVIIA) aprobado por la FDA22. Con base en especímenes disecados capturados en la naturaleza, se sugirió que C. magus experimentó un cambio en su dieta de caza de gusanos a peces durante la ontogenia23, pero falta evidencia empírica debido a los desafíos para acceder a las primeras etapas de su vida.

Aquí cultivamos Conus magus desde cápsulas de huevos hasta larvas en eclosión y, a través de la metamorfosis, hasta juveniles carnívoros. Después de la metamorfosis, se observó que los juveniles de C. magus se alimentaban exclusivamente de gusanos poliquetos utilizando dientes radiulares ancestrales y un repertorio de veneno único, antes de pasar a la caza de peces en la edad adulta. A través de una combinación de enfoques experimentales, demostramos cómo la transición de la caza de gusanos a la caza de peces durante la ontogenia está marcada por una serie de cambios coordinados que abarcan todos los niveles de la organización biológica. Nuestros resultados muestran cómo los especímenes criados en laboratorio pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre la ecología de las etapas secretas de la vida y resaltar el potencial de los caracoles cono juveniles como una fuente sin explotar de nuevos péptidos venenosos bioactivos que, de otro modo, solo serían accesibles mediante la captura de exones o la secuenciación del genoma.

Como la gran mayoría de los cenogastrópodos, los caracoles cono son gonocóricos (los machos y las hembras existen como individuos separados), y las hembras de C. magus depositan sus huevos en cápsulas semirrígidas, generalmente en la parte inferior de una roca de coral (Fig. 1a, b). ; Película complementaria 1). Con base en el diámetro del huevo, anteriormente se pensaba que esta especie sufría una metamorfosis inmediatamente después de la eclosión (lecitotrofia)24, pero en cambio encontramos que las larvas tenían una fase obligatoria de natación libre y alimentación por filtración (planctotrofia), consistente con la amplia distribución de esta especie. especies en toda la región del Indo-Pacífico25. Después de 21 días, las cápsulas de huevos liberaron larvas planctónicas que tenían una cáscara delgada y semitransparente que constaba de 1,5 verticilos y medía 712 ± 30 µm (media ± DE, n = 10) de longitud. La natación y la alimentación en los estadios larvales fueron facilitadas por el velo, que estaba dividido en cuatro lóbulos. Cada lóbulo tenía dos bandas de células ciliadas a lo largo de su periferia y células pigmentadas de amarillo distribuidas a lo largo de sus márgenes (Fig. 1c). Un día después de la eclosión (dph), el esófago larvario consistía en un tubo simple de epitelio ciliado que canalizaba las microalgas ingeridas desde la boca hasta el estómago. A ~ 50 µm de la boca, se encontró un parche de células agrandadas que carecían de cilios apicales incrustados en la pared ventral del esófago (Fig. 2a; Fig. Suplementaria 1a, b). En los días siguientes, esta zona de células no ciliadas se extendió hacia delante y hacia atrás, y finalmente se separó del esófago para dar lugar a la cavidad bucal y al saco radular, en consonancia con observaciones previas en la larva de Conus lividus5.

Conus magus tiene una historia de vida bifásica que incluye larvas planctónicas que se convierten en juveniles carnívoros bentónicos después de la metamorfosis. a Hembra adulta ponedora de C. magus utilizada en este estudio. Barra de escala = 20 mm. b Los huevos se depositaron en cápsulas semirrígidas, generalmente colocadas en la parte inferior de una roca de coral. Cada cápsula contenía entre 500 y 700 huevos. Barra de escala = 20 mm. c Después de 21 días, las cápsulas de huevos liberaron larvas planctónicas que tenían una cáscara delgada y translúcida y un pie ventral (f). La natación y la alimentación en los estadios larvales fueron facilitadas por el velo (v), que dirigió las microalgas capturadas a la boca (m). Barra de escala = 0,5 mm. d Metamorfosis y calcificación de la concha en el juvenil temprano de 0 a 10 dps (días después del asentamiento). Larva tardía asentada a 0 dps (=15 dph) que muestra los lóbulos velares retraídos dentro del caparazón, lo que sugiere una metamorfosis inminente. A 1 dps, el velo se reabsorbió completamente en la región de la cabeza y los pigmentos amarillos se concentraron en dos masas a cada lado de la cabeza. En los días siguientes, la cáscara se calcificó rápidamente y se volvió de color naranja brillante de 2 a 6 dps. Se observó que los juveniles se alimentaban de gusanos desde los 10 dps, pero el rápido crecimiento del caparazón después de los 6 dps sugiere que la carnivoría pudo haber comenzado antes. Las puntas de flecha blancas señalan el límite del caparazón entre larvas y adultos. Barra de escala = 0,5 mm.

La morfogénesis del aparato venenoso se inició temprano durante el desarrollo larvario y sus componentes se elaboraron a partir del esófago distal (intestino anterior). a El esófago de las larvas en eclosión consistía en un tubo simple de epitelio ciliado, con la posible cavidad bucal y el saco radular que se elevaban desde un parche de células agrandadas incrustadas en la pared ventral del esófago (ver Figura complementaria 1a, b). La punta de flecha negra indica la posición de la boca. b En las larvas tardías, la cavidad bucal y el saco radular pueden verse como cámaras interconectadas debajo del esófago (consulte la figura complementaria 1c). La posible glándula venenosa era evidente como una acumulación de células secretoras en la pared ventral del esófago, posterior a la cavidad bucal (ver Figura complementaria 1d). c El inicio de la metamorfosis estuvo marcado por la reabsorción del velo y la pérdida de la boca larval y el esófago anterior (ver Figura complementaria 1e). d A los 2 dps, el tubo bucal se había formado y los dientes radilares quitinosos comenzaron a acumularse en el saco radular (ver Figura complementaria 1f). e A los 6 dps, la glándula del veneno se había desprendido del esófago, permaneciendo solo conectada a la cavidad bucal, y su extremo distal quedó encapsulado con el bulbo del veneno. dph días posteriores a la eclosión, dps días posteriores al asentamiento.

Al final del desarrollo larvario (15 dph), el caparazón había completado 2,5 verticilos y medía 1360 ± 60 µm (n = 10) de longitud. En esta etapa, el pie mostró una mayor flexibilidad y movilidad, y las larvas ahora eran capaces de arrastrarse sobre superficies sólidas. El saco radular se había originado como una bolsa de la cavidad bucal, y ambas estructuras podían verse como cámaras interconectadas debajo del esófago (Fig. 2b; Fig. 1c complementaria). Inmediatamente posterior al saco radular, la posible glándula venenosa (VG) era evidente como una zona hipertrofiada de células epiteliales secretoras que se extendían hacia la pared ventral del esófago (Figura complementaria 1d). La microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló que pequeños gránulos secretores esféricos comenzaron a acumularse en la capa de células epiteliales del VG, que permaneció confluente con el esófago hasta la metamorfosis. Estos resultados fueron consistentes con observaciones en C. lividus, que mostraron que la mayoría de los elementos del aparato venenoso comenzaron a diferenciarse durante el desarrollo larvario5 para facilitar el rápido cambio a carnívoro después de la metamorfosis.

La metamorfosis implicó una serie de cambios estructurales y de comportamiento que permitieron la transición de una larva nadadora y que se alimenta por filtración a un juvenil bentónico y carnívoro. El proceso se provocó mediante la adición de un sustrato adecuado para inducir el asentamiento de las larvas [rocas cubiertas de algas coralinas costrosas (CCA)]. Después del asentamiento, la metamorfosis se inició mediante la reabsorción del velo en la región de la cabeza, con los pigmentos amarillos que bordean su margen concentrándose en dos masas a cada lado de la cabeza (Fig. 1d). En este caso, las dos bandas de células ciliadas se descartaron sobre el sustrato adyacente.

Un día después del asentamiento (dps), las dos masas de células velares involucionadas que surgen de la reabsorción del velo se podían ver a cada lado de la cabeza, debajo de los ganglios cerebrales, y se perdían la boca larval y el esófago anterior (Fig. .2c; Figura complementaria 1e). A los 2 dps, la mayoría de las células velares involucionadas se habían eliminado de la región de la cabeza y los odontoblastos ubicados en el brazo largo del saco radular habían comenzado a secretar dientes radilares quitinosos (Fig. 2d). La probóscide y su vaina (tribuna) se habían formado, aunque los perfiles mitóticos de las células en división indicaban una diferenciación en curso (Figura complementaria 1f). La boca post-metamórfica se creó de novo en el extremo anterior de la probóscide, así como el tubo bucal, que conecta la boca con la cavidad bucal (Fig. 2d). La rápida aparición de estas estructuras sugiere que pueden surgir a través de la transdiferenciación de las células velares, como se propuso anteriormente26. Esto es consistente con la reabsorción concomitante del velo y la observación de células pigmentadas velares que se concentran en la región de la cabeza y migran a lo largo del esófago de 1 a 3 dps (Fig. 1d).

A los 6 dps, todos los elementos del aparato de veneno estaban presentes y completamente diferenciados (Figs. 2e y 3). El brazo corto del saco radular había comenzado a acumular dientes radulares quitinosos maduros y la cavidad bucal se había estrechado para formar el esófago, inmediatamente posterior al saco radular (Fig. 3a, b). En esta etapa, el VG se había desprendido de la pared ventral del esófago y solo permanecía conectado a la cavidad bucal (extremo proximal) (Fig. 3a, c), mientras que su extremo ciego se había diferenciado en un bulbo de veneno visible (extremo distal). que comprende dos capas de fibras musculares que encierran una luz amplia (Fig. 3a, d). La conexión entre el VG y el bulbo se mantenía mediante un canal delgado que recorría la vaina muscular hasta la luz del bulbo. El VG juvenil consistía en un tubo de epitelio cuboide secretor rodeado por una fina capa de fibras musculares. El citoplasma de las células secretoras estaba lleno de una variedad de gránulos densos y esféricos, que recuerdan a los gránulos que se encuentran en los venenos inyectados. La disociación de las células secretoras de la lámina basal y la ruptura de su membrana indican que los gránulos se liberan mediante un proceso holocrino (Fig. 3e; Fig. complementaria 2b, c). La transición a un estilo de vida bentónico estuvo marcada por la calcificación del caparazón, que se volvió de color naranja brillante entre 1 y 6 dps (Fig. 1d), mejorando la cripsis después del asentamiento en rocas cubiertas de CCA.

Seis días después del inicio de la metamorfosis, todos los componentes del aparato venenoso estaban presentes y completamente diferenciados. a Vista lateral izquierda del aparato de veneno reconstruido a partir de secciones histológicas teñidas. Las líneas de puntos indican los planos de sección que se muestran en c, d, con las puntas de flecha negras que indican las regiones del saco radular y la glándula venenosa seccionadas en b, e, respectivamente. b La microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló que el brazo corto del saco radular (rss) había comenzado a acumular dientes radilares quitinosos (numerados del 1 al 3) (consulte la figura complementaria 2a). Barra de escala = 5 μm. c Justo detrás de la cavidad bucal, la glándula venenosa (vg) corre debajo del esófago (oe). Barra de escala = 30 μm. d El extremo ciego de la glándula del veneno estaba encapsulado con el bulbo del veneno (vb), que constaba de dos capas de fibras musculares (1,2) separadas por una fina capa de colágeno (punta de flecha negra) que encierra una luz ancha (lu). Barra de escala = 30 μm. e TEM de una sección transversal a través de la glándula venenosa proximal. El citoplasma de las células de la glándula venenosa estaba lleno de pequeños gránulos secretores esféricos (ver Figura complementaria 2b, c). La disociación de las células epiteliales de la lámina basal (punta de flecha blanca) y la rotura de su membrana indican la secreción holocrina de gránulos de veneno hacia la luz (lu). Barras de escala = 10 μm. bc cavidad bucal, bt tubo bucal, lu lumen, m boca, n núcleo, oe esófago, pr probóscide, rsl brazo largo del saco radular, rss brazo corto del saco radular, vb bulbo de veneno, vg glándula de veneno. Se seccionaron cuatro juveniles a 6 dps, uno usado para la reconstrucción 3D y otro para TEM.

La transición a la edad adulta en C. magus estuvo marcada por un cambio drástico en la preferencia de presas acompañado de profundos cambios morfológicos y de comportamiento. Si bien los adultos son piscívoros estrictos, las larvas de Danio rerio (pez cebra) no lograron desencadenar comportamientos depredadores de los juveniles, que en cambio se observaron que se alimentaban exclusivamente de gusanos poliquetos (familia Syllidae) utilizando un comportamiento de búsqueda de alimento de “picadura y acecho” (Fig. 4a). . La vermivoría temprana en C. magus se infirió previamente a partir de especímenes disecados capturados en la naturaleza, aunque solo se recuperaron setas de gusanos en el tracto digestivo de tres juveniles de >4 mm23. Además, no se mencionan los métodos utilizados para la identificación de especímenes pequeños y la alta similitud morfológica entre los caracoles cono juveniles sugiere que el muestreo podría haber incluido otras especies. El presente estudio proporciona evidencia empírica de vermivoría estricta en juveniles de C. magus. El comportamiento alimentario de los juveniles se iniciaba mediante la extensión de la probóscide que sondeaba la superficie del gusano en preparación para la inyección de veneno. Después de varios minutos, un diente radular sostenido en la punta de la probóscide fue clavado en el gusano y la probóscide se retiró rápidamente dentro de la tribuna, dejando a la presa suelta. El envenenamiento indujo hipoactividad en las presas de gusanos, caracterizada por la pérdida de los comportamientos normales de natación, ocultamiento y escape. Luego, el caracol acechó a su presa durante varios minutos antes de extender su rostro y engullir al gusano por completo (Película complementaria 2). De vez en cuando, los gusanos eran picados por segunda vez. Se observó la misma secuencia de alimentación en todos los juveniles a partir de los 10 dps, aunque la histología y el rápido crecimiento del caparazón entre 6 y 10 dps sugieren que la carnivoría pudo haber comenzado antes (Fig. 1d). Este comportamiento de búsqueda de alimento de “picadura y acecho” fue consistente con el diente radiular juvenil que carecía de púas apicales, hojas y estrías (Fig. 4b; Fig. complementaria 2a), como se observa en especímenes capturados en la naturaleza23. La apófisis accesoria en forma de gancho y el ligamento basal que se observan en el diente permanente también estaban ausentes. El diente radicular juvenil era corto en longitud absoluta y relativa, midiendo 69,7 ± 1,15 µm (n = 5) de longitud para una longitud de concha (SL) de 1,71 ± 0,08 mm (n = 5) (4,1% de SL). Tenía cintura y una base ancha con una amplia abertura, como se ve típicamente en las especies vermívoras. Curiosamente, también se encuentran dientes similares en cazadores juveniles de gusanos 27 y moluscos (Rogalski, A. et al., manuscrito en preparación), lo que indica que este rasgo se ha conservado en las primeras etapas de la vida en todos los Conidae. Los análisis morfométricos confirmaron la similitud con los dientes radulares de los caracoles cono vermívoros (Figura complementaria 3; Datos complementarios 1), y la presencia de dientes similares en linajes conoides relacionados como Mitromorphidae y Borsoniidae28,29 sugiere que este rasgo puede ser plesiomórfico dentro del grupo.

La transición a la edad adulta en C. magus estuvo marcada por un cambio en la preferencia de presas acompañado de cambios morfológicos y de comportamiento. a Se observó que los primeros juveniles se alimentaban exclusivamente de gusanos sílidos con un comportamiento de búsqueda de alimento de “picadura y acecho”. Primero, los gusanos eran apuñalados por un diente radular corto y sin púas, y la probóscide se retraía rápidamente dentro de la tribuna, dejando a la presa suelta. La inyección de veneno indujo hipoactividad en las presas de los gusanos. Luego, el juvenil acechaba a su presa antes de tragársela entera. b Diente radiular juvenil extraído de microscopía electrónica de barrido (SEM) (consulte la figura complementaria 2a). Este comportamiento de búsqueda de alimento de “picadura y acecho” era consistente con el diente radular juvenil que carecía de púas apicales, láminas y dentados. El diente radicular juvenil era corto en longitud absoluta y relativa y se caracterizaba por un eje corto, una cintura y una base ancha con una amplia abertura. c Los adultos de C. magus muestran el típico comportamiento de búsqueda de alimento de “anzuelo y sedal”, en el que el pez presa es picado por un diente radular en forma de gancho, mientras que potentes neurotoxinas inducen rápidamente una parálisis rígida. Luego, el pez paralizado se ata dentro de la tribuna y se traga entero. d Diente radular adulto extraído de SEM (ver Figura complementaria 4a). Obsérvese la presencia del proceso accesorio en forma de gancho (ac.pro) en el ápice del diente que facilita atar al pez picado. Los dientes radiales están magnificados 25x en relación con el tamaño de los animales.

Por el contrario, los C. magus adultos son piscívoros estrictos y capturan presas utilizando un comportamiento de búsqueda de alimento de “anzuelo y línea”30 (Fig. 4c). Esta estrategia se basa en un diente radiular similar a un arpón (Fig. 4d; Fig. complementaria 4a) para administrar potentes neurotoxinas que se dirigen a la musculatura esquelética del pez, produciendo una parálisis rígida inmediata caracterizada por la extensión continua de las aletas30,31. La fuerte apófisis accesoria (púa recurvada) en el ápice del diente permite sujetar firmemente al pez, que luego se retira a la tribuna y se traga entero. El diente radiular adulto era largo (3,4 ± 0,1 mm; n = 5) (SL = 53 mm) (6,4% de SL), con una base pequeña unida a un ligamento flexible. Se cree que este rasgo ha evolucionado de manera convergente en los conos de caza de peces del Atlántico/Pacífico Oriental y del Indo-Pacífico que emplean un comportamiento de búsqueda de alimento similar de “anzuelo y línea”30,32, lo que sugiere el fuerte valor adaptativo de este carácter.

Para comparar la expresión de genes de conotoxina durante la ontogenia, se generaron transcriptomas de novo a partir de C. magus embrionario (n ~ 500), juvenil (n = 2) y adulto (n = 1). Después del filtrado de calidad, 5.410.000 lecturas obtenidas de la secuenciación de dos C. magus juveniles se ensamblaron en 140.457 contigs de una longitud promedio de 468,3 nucleótidos. La anotación del transcriptoma mediante búsquedas blastx y blastp dio como resultado la identificación de 68 transcripciones completas que codifican toxinas (59 péptidos maduros, 10 estructuras de cisteína). Entre estos, 58 podrían clasificarse en 16 familias de genes de conotoxinas, dominadas por las superfamilias O1, H, M y O2 (47,1% de las transcripciones, 60,4% de la expresión combinada) (Fig. 5a; Datos complementarios 2). Los juveniles de C. magus también expresaron una serie de conopéptidos similares a hormonas (n = 10) que combinados contribuyeron con el 1,7% de la expresión total. Estos incluían dos consomatinas (consomatin_M2 y M3), una familia de péptidos que imitan la somatostatina que han sido reclutados en el arsenal de veneno de muchas especies de caracoles cono, probablemente para facilitar la captura de presas33. Consomatin_M2 y consomatin_M3 compartían similitudes con los péptidos relacionados con la somatostatina de señalización de anélidos (Figura complementaria 5), ​​lo que sugiere que podrían usarse para cazar gusanos en juveniles antes de ser regulados negativamente en la edad adulta, como se había planteado previamente33. De acuerdo con su dieta, las transcripciones juveniles altamente expresadas compartían una alta similitud de secuencia con las conotoxinas vermívoras (Figura complementaria 6), lo que indica un fuerte vínculo entre la ecología de la alimentación y la bioquímica del veneno. Dado que la distribución heterogénea de toxinas a lo largo del VG ha sido ampliamente documentada en Conidae34,35,36, el VG adulto se dividió en regiones proximales y distales que se secuenciaron de forma independiente, produciendo 5.030.000 y 5.590.000 lecturas de alta calidad que se ensamblaron en 87.157 y 97.528 contigs de una longitud media de 487,8 nucleótidos. La anotación de los transcriptomas VG maternos condujo a la identificación de 69 transcripciones únicas de longitud completa que codifican toxinas (52 péptidos maduros, 9 estructuras de cisteína). Entre estos, 61 podrían clasificarse en 12 familias de genes de conotoxinas, con el VG proximal dominado por las superfamilias O1, M y T (58,1% de las transcripciones, 63,7% de la expresión), mientras que el VG distal estuvo dominado por las superfamilias A, O1 y Superfamilias M (61% de las transcripciones, 83,5% de la expresión) (Fig. 5a; Datos complementarios 2). Estos hallazgos fueron consistentes con estudios recientes en los que las superfamilias M, O1, T y A dominaron los transcriptomas VG de especímenes adultos de C. magus de Japón y Filipinas37, lo que sugiere que diferentes poblaciones de esta especie comparten un repertorio similar de conotoxinas en la edad adulta. El VG adulto también comprendía una serie de conopéptidos similares a hormonas (n = 8) que combinados contribuyeron con el 1,2% y el 14,1% de la expresión en las regiones proximal y distal, respectivamente. Sorprendentemente, solo se compartieron 10 precursores de conotoxinas entre los transcriptomas VG juveniles y adultos maternos, con cinco precursores compartidos entre nuestro transcriptoma juvenil y especímenes adultos de Japón y Filipinas37. El análisis de componentes principales (PCA) confirmó la expresión diferencial de las familias de genes de conotoxina entre C. magus juvenil (n = 2) y adulto (n = 2) (Fig. 5b). Las PC más bajas (PC1 y PC2) representaron el 52,9% y el 31,8% de esta variación, impulsada principalmente por la sobreexpresión de las superfamilias A, M y T en adultos y la sobreexpresión de las superfamilias O1, L y B2 en jóvenes (Datos complementarios 3) .

La transcriptómica y proteómica combinadas revelaron la ontogenia del veneno en C. magus. a Distribución de precursores de conotoxinas y conopéptidos similares a hormonas (Conopep.) en los transcriptomas juveniles y adultos. El transcriptoma del veneno juvenil estuvo dominado por las superfamilias O1, H, M y O2, mientras que el transcriptoma del veneno adulto estuvo dominado por las superfamilias O1, A, T y M. b Gráfico biplo de análisis de componentes principales que compara la composición del veneno entre C. magus juvenil (verde) y adulto (azul) de Australia (Aus) y Filipinas (Phi). La longitud de la flecha indica con qué fuerza cada variable (superfamilias de genes de conotoxinas) influye en los componentes principales (PC). Ejes izquierdo e inferior: puntuaciones de PC de muestras. Ejes derecho y superior: cargas de variables. La posición de los juveniles de C. magus en el extremo de PC1 está impulsada por la sobreexpresión de las superfamilias O1, L y B2, mientras que la ubicación de los especímenes adultos se explica en gran medida por la sobreexpresión de las superfamilias A, M y T. c MALDI-TOF-MS de alta resolución reveló diferentes composiciones de péptidos entre el VG juvenil y adulto, y la distribución heterogénea de conotoxinas a lo largo del VG adulto. Los asteriscos indican masas que también se encuentran en experimentos de LC-MS en las muestras correspondientes. d Distribución de masas monoisotópicas (≥0,1% de la expresión) en los proteomas VG juveniles y adultos. Los datos de origen para transcriptómica, PCA y proteómica se proporcionan como Datos complementarios 2 a 4, respectivamente.

Si bien las superfamilias O1 y M representaron una gran proporción de transcripciones en C. magus tanto juvenil como adulto, las conotoxinas pertenecientes a estas superfamilias mostraron una diversidad notable en sus secuencias señal y péptidos maduros codificados. Según la similitud de la secuencia señal, las conotoxinas M se pueden dividir en dos grupos38. Todas las conotoxinas M embrionarias y juveniles (n = 9) pertenecían al grupo MLKM, mientras que C. magus adulto también incluía precursores del grupo MMSK (Datos complementarios 2). Las secuencias maduras de conotoxinas M (estructura de cisteína III, CC-CC-CC) se pueden dividir en cinco ramas (M-1 a M-5) según el número de residuos entre la cuarta y quinta cisteínas39. Tanto el VG adulto proximal como el distal expresaron un precursor de la rama M-4 (M_M3.6i), que se encuentra en los caracoles cono piscívoros e incluye conotoxinas κM, ψ y μ que inducen parálisis en los peces39. Este precursor, junto con otros dos precursores que codifican el mismo péptido maduro (PMAG100 y PMAG106), también se encontraron en C. magus adultos de Japón y Filipinas37. Por el contrario, el transcriptoma juvenil incluía solo conotoxinas de rama M-1 que se encuentran principalmente en caracoles conos cazadores de moluscos y gusanos y que se sabe que provocan una respuesta espasmódica en las presas38,40 (Datos complementarios 2).

Para explorar la divergencia de las conotoxinas O1 entre C. magus juveniles y adultos, realizamos un análisis filogenético. (Figura complementaria 7). Si bien todos los precursores de la superfamilia O1 compartían el mismo marco de cisteína VI/VII (CC-CC-CC), nuestra historia filogenética fue consistente con estudios previos que dividieron la superfamilia en cuatro grupos parálogos con farmacologías distintas37. En particular, O1_M6.53 y O1_M6.54 juveniles nuevos y altamente expresados ​​(49,7% de la expresión combinada) se bifurcaron temprano dentro del grupo parálogo O1-2, que comprendía conotoxinas vermívoras de función desconocida, mientras que la presencia de precursores adultos de baja expresión (<1,5 % de expresión) dentro de este grupo sugiere que estos pueden estar regulados negativamente en la edad adulta. Apoyando la divergencia de las conotoxinas juveniles, su señal conservada y sus regiones prepropéptidos diferían de los correspondientes precursores adultos del mismo grupo parálogo. Por el contrario, los precursores adultos altamente expresados ​​se agruparon dentro de los grupos parálogos O1-1 (35,4% y 14,4% en VG proximal y distal, respectivamente) y O1-3 (0,5% y 18,6%, respectivamente) que incluyen ω- y δ-conotoxinas. dirigido a los canales de calcio y sodio de vertebrados, respectivamente41,42 (Figura complementaria 7). La diversidad de conotoxinas de especies piscívoras dentro de estos grupos parálogos apoya la idea de que los eventos de duplicación genética y la posterior divergencia funcional dentro de esta familia de genes facilitaron la evolución adaptativa de la piscívora43,44. Identificamos una supuesta δ-conotoxina (O1_M6.61ii; estructura de cisteína VI/VII) agrupada dentro del grupo parálogo O1-3 que se compartía entre transcriptomas embrionarios, juveniles y adultos. Esta variante de δ-MVIC (91% de similitud en la región peptídica madura) compartía una alta similitud de secuencia con δ-conotoxinas de otros caracoles cono piscívoros, incluido un parche hidrofóbico conservado importante para la actividad en los canales de sodio de los vertebrados45.

La ontogenia del veneno en C. magus también estuvo marcada por la diversificación de la superfamilia A. Como se observa típicamente en especies piscívoras46,47,48,49, esta superfamilia era estructural y funcionalmente diversa en C. magus adulto, incluidas las κA-conotoxinas altamente expresadas (estructura de cisteína IV, CC-CCCC) que causan hiperexcitabilidad de los axones en la inyección del veneno. sitio, lo que resulta en una rápida parálisis rígida de la presa9. Los valores altos de expresión de κA-conotoxinas en el VG adulto (25,5% y 47,6% en VG proximal y distal, respectivamente) fueron consistentes con los síntomas observados en las presas de peces durante la alimentación (Fig. 4c; Datos complementarios 2). Identificamos dos nuevas conotoxinas κA putativas que contenían treoninas conservadas en las posiciones 7, 9 y 10 que a menudo están glicosiladas postraduccionalmente50. A_M4.7ii, una variante de κ-MIVA (94 % de similitud en la región peptídica madura), se encontró en C. magus juveniles y adultos, mientras que A_M4.6 era exclusivo de los embriones. La superfamilia A también incluía α-conotoxinas inhibidoras (estructura de cisteína I, CC-CC) que se dirigen a los receptores nicotínicos de acetilcolina para inducir parálisis fláccida persistente en vertebrados51,52. Estos podrían asignarse además a los subgrupos α3/5 (A_M1.17), α4/7 (A_M1.2) y α4/4 (A_M1.7). A diferencia de las conotoxinas κA, las conotoxinas α se restringieron al VG adulto (Datos complementarios 2).

A pesar de alimentarse de gusanos, la alta similitud de secuencia con las conotoxinas caracterizadas y las estructuras de cisteína conservadas sugiere que las conotoxinas κA y δ juveniles pueden actuar sobre los canales iónicos de los vertebrados. De hecho, se planteó la hipótesis de que las δ-conotoxinas activas en vertebrados identificadas previamente en caracoles cono vermívoros adultos surgieron primero para la defensa y luego se reutilizaron para facilitar el cambio evolutivo de la caza de gusanos a la de peces53,54,55. Sin embargo, aún está por determinar si las conotoxinas κA y δ juveniles pueden usarse para disuadir a los depredadores vertebrados y/o facilitar la depredación de gusanos. Además, identificamos una nueva conotoxina O2 juvenil (O2_M6.62; estructura de cisteína VI/VII) que compartía una alta similitud de secuencia con las γ-conotoxinas de especies de moluscívoros, pero carecía del motivo –ECCS– donde el ácido glutámico se modifica postraduccionalmente a γ. -carboxiglutamato42 (Figura complementaria 6). Esto sugiere que las γ-conotoxinas que producen fuertes efectos paralíticos en los moluscos42 pueden haber evolucionado primero para disuadir a los depredadores de los moluscos antes de ser reutilizadas para la depredación en linajes de moluscívoros.

Además, se recuperaron del transcriptoma juvenil 18 conotoxinas únicas que muestran la estructura de cisteína VI/VII y con farmacología indefinida (Datos complementarios 2). Esta disposición de cisteína se asocia típicamente con el motivo estructural del nudo inhibidor de cisteína (ICK)56. Los péptidos que adoptan este pliegue muestran una variedad de actividades biológicas, incluido el inhibidor de los canales de calcio de tipo N clínicamente utilizado, la ω-conotoxina MVIIA (Prialt®)22,57, lo que destaca el potencial de los caracoles cono juveniles como una fuente sin explotar de nuevos péptidos bioactivos.

Para investigar más a fondo la ontogenia del veneno en C. magus, se compararon los proteomas VG juveniles (n = 20) y adultos (n = 1) mediante espectrometría de masas. La espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) reveló que los proteomas de VG juveniles y adultos estaban dominados por distintos conjuntos de péptidos <6 kDa, con masas >4 kDa restringidas al VG adulto ( Figura 5c, Figura complementaria 8a, Datos complementarios 4). Además, los diferentes patrones de EM obtenidos de VG proximal y distal respaldan la distribución heterogénea de conotoxinas a lo largo del VG adulto. Si bien MALDI-MS es una técnica útil para la elaboración de perfiles de veneno completo, este enfoque sufre una serie de limitaciones, incluido el bajo rango dinámico y los efectos de supresión de iones, que impiden la detección de la complejidad completa del veneno58. Para complementar MALDI-MS, además realizamos cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) en los extractos de C. magus VG juveniles y adultos. Teniendo en cuenta la complejidad de los venenos de los caracoles cónicos y el rango de masa típico de las conotoxinas, solo se consideraron masas monoisotópicas entre 1 y 10 kDa y que cubrían ≥0,1% de la intensidad relativa para facilitar la interpretación ecológica (Datos complementarios 4). Se detectaron un total de 123 masas (104 únicas) en el VG adulto, mientras que se encontraron 92 masas (86 únicas) en el VG juvenil. La comparación de las listas de masas reveló que solo se compartía una masa (1438,01 Da) entre ambos proteomas del veneno, lo que respalda las diferencias observadas por MALDI-MS. Mientras que el proteoma VG juvenil estuvo dominado en gran medida por péptidos que caían en el rango de masa de 1 a 2 kDa (n = 53, 57,6% de las masas), el proteoma VG adulto contenía una gran proporción de péptidos de 4 a 6 kDa (n = 48, 39). % de masas) en comparación con los juveniles (n = 10, 10,9% de masas) (Fig. 4d; Fig. complementaria 8b).

Para identificar las conotoxinas utilizadas para la captura de presas vertebradas por C. magus adultos, se obtuvo el veneno depredador ordeñado (MPV) de la hembra ponedora utilizando un pez para provocar una respuesta depredadora59. A pesar de la diversidad de péptidos del veneno que se encuentran dentro del VG materno, el MPV estuvo dominado por péptidos en el rango de masa de 4 a 6 kDa (76,5% de las masas) que eluyen al 25-30% de acetonitrilo (Fig. 4e; Figs. complementarias 8, 9). ). Este rango de masa y ventana de elución son típicos de las κA-conotoxinas O-glicosiladas excitadoras, que dominan el veneno depredador de las especies hermanas C. catus y C. striatus48,49. Los grupos de glicanos identificados en 204,08 (HexNAc), 366,13 (HexHexNAc) y 528,19 (Hex2HexNAc) m/z fueron prominentes en esta ventana de elución tanto en VG como en MPV adultos (Figura complementaria 9). Estos hallazgos indican que el MPV de C. magus adulto también está dominado por péptidos glicosilados, presumiblemente κA-conotoxinas, lo que es consistente con su alta expresión transcriptómica. Por el contrario, el MPV carecía de los componentes del veneno más hidrofóbicos y de los péptidos de menor peso molecular presentes en cualquiera de las regiones del VG adulto, como se observó previamente en el piscívoro C. consors60 (Fig. 5c; Fig. complementaria 8).

La presencia de conotoxinas κA en adultos de C. magus fue respaldada además por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), con la identificación de conotoxinas similares a κA A_M4.5 en el MPV y A_M4.7 en el adulto. VG (Tabla complementaria 1), este último consistente con su alta expresión transcriptómica tanto en el VG proximal (4,3%) como en el distal (25,5%). Otros péptidos identificados tanto en VG como en MPV adultos incluyeron conotoxinas O1 (O1_M6.15, O1_M6.60, O1_M7.4 y ω-conotoxinas MVIIA [Prialt®] y MVIIB), conotoxinas S (S_M8.1 y S_M8.6), Conotoxina M M_M3.4 (grupo MMSK), conotoxina T T_M6, conkunitzinas (conkunitzin_M9.10, conkunitzin_M9.12, conkunitzin_M14.9) y conoporinas (conoporina_M1 y conoporina_M6). De acuerdo con nuestros experimentos de secuencia de ARN, también se encontraron α-conotoxina MII (A_M1.2), conotoxina similar a α A_M1.17 y conotoxina similar a δ O1_M6.61 dentro del VG adulto, pero faltaban en el MPV (Tabla complementaria 1). ). Desafortunadamente, la MS/MS en el VG juvenil no fue factible debido a la muestra limitada disponible.

Nuestros análisis transcriptómicos y proteómicos respaldan la distribución heterogénea de conotoxinas a lo largo del VG adulto, consistente con los primeros estudios de C. magus que muestran que los extractos de VG proximales indujeron parálisis fláccida en peces y ratones, mientras que los extractos de VG distales indujeron parálisis rígida30. Respaldando este patrón de expresión espacial, las células secretoras que recubren las regiones proximal y distal del VG adulto diferían en su ultraestructura y productos secretores (Figuras complementarias 4b, c). Por el contrario, el VG juvenil parecía estructuralmente homogéneo (Figuras complementarias 2b, c), pero la caracterización funcional de las regiones proximal y distal se vio impedida por el pequeño tamaño del VG juvenil (<0,5 mm). Aún no se ha dilucidado por completo hasta qué punto la compartimentación estructural del VG en desarrollo coincide con la diversificación de las conotoxinas activas en vertebrados y el cambio de la vermivoría a la piscivoría.

En conclusión, este estudio ha revelado que el cambio de la caza de gusanos a la caza de peces durante el desarrollo de C. magus está sustentado por complejos cambios morfológicos, de comportamiento y moleculares. Este paralelo entre ontogenia y filogenia se hace eco de la ley biogenética de Haeckel61 y nuestros hallazgos respaldan evidencia previa de que los cazadores de peces evolucionaron a partir de ancestros vermívoros11,12. Los enfoques transcriptómicos y proteómicos combinados revelaron la expresión de conotoxinas específicas de presas a lo largo de la historia de vida, lo que indica un fuerte vínculo entre la ecología alimentaria y la composición del veneno, como se observa en otros taxones venenosos62,63,64. La distinta composición de los venenos juveniles proporciona nuevos conocimientos sobre la evolución de las conotoxinas y nuevas oportunidades para el descubrimiento de péptidos de veneno con estructuras y funciones novedosas, incluso en especies ampliamente estudiadas. Nuestra investigación de especímenes criados en cautiverio brinda nuevas oportunidades para estudios genéticos comparativos y podría ayudar a reducir la dependencia de las poblaciones silvestres, que son explotadas intensivamente para el comercio de conchas ornamentales65.

Los especímenes adultos de Conus magus de la Gran Barrera de Coral (Queensland, Australia) se obtuvieron de Cairns Marine (Cairns, Queensland, Australia) y se mantuvieron en tanques de cría de 8 L en un laboratorio PC2 con un sistema cerrado de recirculación de agua salada. La temperatura del agua se fijó en 26 ± 1 °C, con un ciclo de luz y oscuridad (LD) de 12:12 horas. Los parámetros del agua y la salud de los animales se monitorearon diariamente y se proporcionó alimento (pez cebra) semanalmente. El uso de pez cebra (Danio rerio) en este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Queensland (número de aprobación 2019/AE000271). Se agregaron rocas de coral (Cairns Marine) a los tanques para proporcionar un sustrato para la fijación de los huevos. Las cápsulas de huevos se retiraron del tanque al día siguiente de la oviposición, se enjuagaron con agua de mar ultrafiltrada (0,22 μm) y se colocaron en tanques de 1 litro esterilizados con UV llenos de agua de mar ultrafiltrada procedente de Caloundra, Queensland. Los tanques de cultivo se mantuvieron bajo un ciclo LD de 12:12 horas, a temperatura ambiente (24 ± 1 °C). Cada día, un tercio del agua fue reemplazada por agua de mar fresca ultrafiltrada hasta la eclosión. Se agregaron antibióticos de penicilina/estreptomicina (50 μg/ml) semanalmente a los tanques de cultivo para minimizar la contaminación bacteriana. Dentro de las 24 h posteriores a la eclosión, las larvas se pipetearon suavemente en tanques de 1 L esterilizados con UV, llenos con agua de mar filtrada de 10 μm a una concentración de 25 larvas/L. Se les alimentó diariamente con una mezcla hecha de cantidades iguales de Tisochrysis lutea y Chaetoceros muelleri vivos (Colección Nacional de Cultivos de Algas de Australia, CSIRO, Australia) a una concentración de 15 × 103 células/ml. Las larvas se transfirieron a tanques de cultivo limpios cada dos días mediante pipeteo manual, y los especímenes muertos y no saludables se identificaron visualmente y se descartaron. Las larvas se cultivaron en un ciclo de LD de 12:12 horas, a temperatura ambiente (24 ± 1 °C) sin adición de antibióticos. Se indujo a las larvas tardías a asentarse en rocas cubiertas de CCA procedentes de la Gran Barrera de Coral (Cairns Marine). Los primeros juveniles se transfirieron a tanques de 1 litro de agua de mar ultrafiltrada esterilizados con luz ultravioleta (50% reemplazados diariamente) y se agregaron rocas cubiertas de CCA como fuente de alimento. Se capturaron imágenes de especímenes vivos (larvas y juveniles) en un estereomicroscopio Leica EZ4 (Leica Microsystems) utilizando el software LAS EZ 3.0.0 (Leica Microsystems), con edición de imágenes (ajustes de brillo y contraste, eliminación de fondo) realizada en Photoshop 21.2.1. .

Tisochrysis lutea y Chaetoceros muelleri se mantuvieron aeróbicamente en matraces estériles de 500 ml en agua de mar artificial enriquecida con medio de cultivo f/266. Los matraces de cultivo se mantuvieron dentro de una incubadora a 24 °C en un ciclo de LD de 14:10 horas. La luz fue proporcionada por tubos fluorescentes a una intensidad de 80 μE.m-2.s-1. Los cultivos primarios se subcultivaron cada semana.

Antes de la fijación, las muestras para histología se anestesiaron mediante incubación en agua de mar artificial con alto contenido de Mg2+/bajo en Ca2+67 durante 60 a 90 minutos antes de colocarlas en hielo durante 5 a 10 minutos. La posterior fijación, descalcificación, deshidratación e infiltración de resina se realizaron con asistencia de microondas al vacío (Pelco). Las muestras se fijaron y almacenaron en glutaraldehído al 2,5% en agua de mar a pH 7,5 durante hasta 2 semanas antes del procesamiento. Las cáscaras de las larvas se descalcificaron en una solución de ácido fórmico (FA) al 0,5%, mientras que las cáscaras más gruesas de los estadios metamórficos y los juveniles se eliminaron cuidadosamente con la ayuda de unas pinzas. Las muestras descalcificadas se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la fijación posterior en tetróxido de osmio al 1% tamponada con cacodilato. Posteriormente, las muestras se deshidrataron en una serie de diluciones con etanol y se infiltraron e incluyeron en resina Epon (ProSciTech). Se obtuvieron secciones transversales seriadas para larvas de 1, 7 y 15 dph, y juveniles de 1, 2 y 6 dps (2 a 4 especímenes en cada etapa). Para microscopía óptica, se cortaron secciones en un ultramicrótomo con un espesor de 1 μm usando una histocuchilla de diatomeas, se tiñeron con azul de toluidina y se tomaron imágenes con una cámara CCD DP70 montada en un microscopio vertical de campo ancho BX51 (ambos Olympus) usando el software Zen Blue 3.2 ( Zeiss). Para la microscopía electrónica de transmisión, se cortaron secciones con un espesor de 80 nm, se recogieron en rejillas de cobre y se tomaron imágenes en un Hitachi HT 7700 equipado con una cámara CMOS de alta sensibilidad (AMT) XR401 utilizando el software TEM System Model HT7700 02.30.15.56 (Hitachi). .

La reconstrucción tridimensional (3D) del aparato de veneno juvenil se obtuvo a partir de secciones transversales en serie tomadas en un escáner de diapositivas AxioScan Z1 utilizando el software Zen 3.5 (ambos Zeiss). Las imágenes individuales se recortaron y apilaron utilizando ImageJ/Fiji 2.0.0 y se realizaron más análisis, visualización y reconstrucción de imágenes con Amira 2021.1 antes de alinear y anotar las secciones manualmente. Luego se generó y suavizó el volumen 3D usando Amira y Photoshop 21.2.1.

Se aislaron dientes radulares maduros del saco radular de muestras disecadas y se lavaron brevemente en una solución de hipoclorito de sodio al 10%. Posteriormente se enjuagaron los dientes con dos lavados de agua UHQ. Los dientes radilares adultos se deshidrataron en una serie de diluciones con etanol antes de la inmersión en dos cambios de hexametildisilazano (HMDS). Después del segundo lavado HMDS, los dientes adultos se secaron al aire a temperatura ambiente durante 30 minutos, mientras que los dientes radulares juveniles se secaron directamente al aire después de los lavados UHQ. Luego se montaron dientes radiales sobre muñones de aluminio utilizando discos adhesivos de carbono y se recubrieron con platino en un recubridor por pulverización catódica CCU-010 (Safematic). Las imágenes se capturaron con un SEM TM4000Plus utilizando el software TM4000 Tabletop Microscope 1.5 (ambos Hitachi). Los datos morfométricos de los dientes radilares se trazaron utilizando Prism 9.4.1 (GraphPad). La significación estadística se definió como P <0,05 utilizando una prueba ANOVA unidireccional y los datos se presentan como medias ± SEM.

Para la secuenciación de ARN, se extrajo ARN total de embriones de cuerpo entero (7 días después de la oviposición, n ~ 500), juveniles (14 dps, n = 2, SL = 1,7 mm) y VG materno (n = 1). Los embriones y los juveniles se colocaron en un volumen de tejido de ARN > 10 veces mayor (Invitrogen) y se almacenaron a –80 °C hasta su extracción. El VG materno se diseccionó y dividió en regiones proximales y distales de tamaños iguales para investigar la distribución espacial de las conotoxinas a lo largo del VG y el ARN extraído de tejido fresco. Se mantuvieron tres segmentos correspondientes a las regiones proximal, central y distal en una solución de acetonitrilo (ACN) al 30 %/FA al 1 % para proteómica, y dos segmentos pequeños (proximal y distal) se colocaron en glutaraldehído al 2,5 % y se procesaron para histología como se describe. arriba. El ARN total se extrajo de todas las muestras utilizando TRIzol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante para producir entre 0,4 y 2,72 μg de ARNm purificado de cada muestra. La calidad y concentración del ARN se evaluaron en un bioanalizador 2100 utilizando el kit RNA 6000 Nano (Agilent). La preparación y secuenciación de la biblioteca de ADN complementaria fueron realizadas por el Instituto de Secuenciación de Biociencia Molecular (Universidad de Queensland). Las bibliotecas se construyeron utilizando el kit Illumina Stranded mRNA Prep. Las muestras se agruparon en un lote de 6 y la secuenciación de extremos emparejados de 600 ciclos (2 × 300 pb) se realizó en un instrumento Illumina MiSeq. Los datos de secuenciación sin procesar se han depositado en el archivo de lectura de secuencias del NCBI con el número de acceso de BioProject PRJNA943605.

El procesamiento de datos sin procesar y el ensamblaje de novo fueron realizados por el Centro de Bioinformática Avanzada de Queensland (Universidad de Queensland). El recorte del adaptador, el recorte de calidad y el filtrado se realizaron utilizando BBDuk (paquete BBTools 38.84, Joint Genome Institute). Luego se realizaron la fusión de lecturas de extremos emparejados y la corrección de errores utilizando BBMerge (BBTools). Las lecturas recortadas y con corrección de errores se ensamblaron de novo utilizando Trinity 2.8.468 utilizando tamaños k-mer de –19 y –31. Los contigs ensamblados de ambos k-mers se fusionaron en conjuntos de datos únicos y se eliminaron los duplicados utilizando Dedupe (BBTools). Luego se buscaron contigs ensamblados en ConoSorter 1.1, un programa interno desarrollado para clasificar las conotoxinas en superfamilias y clases de genes69. Después de traducir las secuencias de ácido nucleico en todos los marcos de lectura posibles, el algoritmo aísla las secuencias codificantes de conotoxinas y las clasifica mediante búsquedas de modelos de Markov ocultos de perfil y expresión regular. El programa busca en la base de datos ConoServer70 y proporciona información adicional para secuencias coincidentes, incluida la frecuencia relativa de la secuencia, la longitud, el número de cisteínas, la hidrofobicidad N-terminal y la puntuación de similitud de secuencia. Las secuencias que contenían <50 y >250 aminoácidos y con una puntuación de hidrofobicidad de la región señal <45% se eliminaron manualmente. Se buscó en todas las secuencias la presencia de una región de señal N-terminal utilizando el servidor SignalP 5.071 y se descartaron las secuencias que carecían de regiones de señal. En esta etapa, las secuencias de nucleótidos se inspeccionaron manualmente y se descartaron las secuencias incompletas o aberrantes (codones de parada internos o nulos, repeticiones, marcos de lectura abiertos incorrectos). Los contigs retenidos se anotaron mediante búsquedas blastx y blastp72 en las bases de datos no redundantes UniprotKB/SwissProt (corte del valor E: 10–3) y Conoserver. Luego se utilizó la herramienta ConoPrec en Conoserver para identificar las regiones señal, propéptido, madura y posmadura y los marcos de cisteína. Los niveles de expresión de todas las lecturas se calcularon en transcripciones por millón (TPM)73 utilizando Kallisto 0.46.174. Se resumieron los niveles de expresión para cada superfamilia de genes y se calculó la expresión relativa (en porcentaje), incluido un espécimen de Filipinas37. Luego realizamos un análisis de componentes principales (PCA) para evaluar el grado de similitudes en la composición del veneno entre C. magus juvenil y adulto utilizando el software estadístico XLSTAT (Addinsoft, versión de prueba gratuita). Para el biplot PCA, se muestran las cuatro variables con mayor influencia en las PC. La matriz de datos, las estadísticas resumidas, la contribución de cada variable (en porcentaje), las puntuaciones de PCA y los gráficos de carga se pueden ver en los Datos complementarios 3. Todos los precursores de péptidos se nombraron de acuerdo con la nomenclatura convencional de conotoxinas (con las especies representadas por una o dos letras). , estructura de cisteína por un número arábigo y, después de un decimal, orden de descubrimiento por un segundo número)75, con ligera modificación76. La superfamilia se agregó como prefijo y los precursores que diferían en sus regiones propéptidos pero con péptidos maduros conservados se diferenciaron con un pequeño número romano como sufijo para distinguir entre variantes menores. Todas las secuencias precursoras de conotoxinas se han depositado en NCBI GenBank [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore] con los números de acceso OQ644315–OQ644445.

Se llevaron a cabo estudios proteómicos basados ​​en MS en el VG combinado de 20 juveniles a 14 dps y en el VG materno (proximal, central y distal). Todas las muestras se extrajeron en 30% ACN/1% FA y se mantuvieron a –20 °C hasta su posterior análisis. Se obtuvieron muestras de veneno provocado por la depredación de la hembra que puso huevos, como se describió anteriormente59. Después de cada ordeño, el tubo colector se centrifugó brevemente y se almacenó a –20 °C hasta el análisis. Para nuestro análisis, se combinaron muestras de veneno de 10 eventos de ordeño independientes y recolectadas durante 18 meses.

En preparación para LC-MS/MS, cada muestra se redujo con trietilfosfina y se alquiló con 2-yodoetanol77, antes de la digestión con tripsina de grado proteómico (Sigma). Este paso se omitió para el extracto de glándula venenosa juvenil debido a la muestra limitada disponible. Las muestras nativas y digeridas se desalinizaron utilizando un ZipTip C18 (Merk Millipore) y se secaron mediante centrifugación al vacío. Las muestras se reconstituyeron en FA al 0,1% y se cargaron entre 50 y 200 ng (estimado a partir de A280) en una columna analítica nanoEase M/Z HSS T3 (Waters; tamaño de poro de 100 Å, tamaño de partícula de 1,8 μm, 300 μm x 150 mm) y se separó en un gradiente lineal de 3 a 60 % de disolvente B (0,1 % de FA en ACN) en disolvente A (0,1 % de FA) durante 20,5 min a un caudal de 5 μl/min. El flujo de salida de LC se acopló a un espectrómetro de masas ZenoTOF 7600 (SCIEX) equipado con una fuente de iones OptiFlow Turbo V. Las muestras se analizaron utilizando el método de adquisición dependiente de datos (DDA) con datos adquiridos en el modo de iones positivos. Los escaneos de MS se adquirieron en una relación masa/carga (m/z) de 400 a 1750 durante 200 ms, y la adquisición de datos se realizó en hasta 20 iones candidatos con una carga de +2 a +6 y una señal > 150 cuentas/s. Los isótopos más intensos se seleccionaron y fragmentaron con espectrometría de masas en tándem de disociación inducida por colisión (CID) y disociación activada por electrones (EAD). Los escaneos MS/MS se recogieron entre 50 y 2000 m/z durante 35 ms. Se utilizó la configuración de energía de colisión dinámica, lo que permite que la energía de colisión varíe según m/z y z del ion precursor. Los datos se adquirieron utilizando OS 3.0.0.3339 y se analizaron en Peakview 2.2 (ambos SCIEX). Los espectros CID-MS/MS se buscaron en una base de datos que combina todas las secuencias traducidas de nuestros experimentos de RNA-seq y conotoxinas de C. magus previamente informadas (Datos complementarios 2) utilizando el algoritmo Paragon78 implementado en ProteinPilot 5.0 (SCIEX) con las siguientes configuraciones: yodoetanol (para muestras reducidas y alquiladas), tripsina digerida (para muestras digeridas), modificaciones postraduccionales de conotoxina común79, modificaciones biológicas, identificación exhaustiva. Los péptidos con ≥2 fragmentos trípticos con una confianza de 99 y una tasa de descubrimiento falso <1% se consideraron genuinos. Los datos de EAD-MS/MS se buscaron en la misma base de datos utilizando Mascot 2.5.180 (Matrix Science) con las siguientes configuraciones: tripsina, 1 escisión perdida, carbamidometilo como modificación fija, oxidación de metionina y desamidación de asparagina y glutamina como variable. modificaciones, tolerancia peptídica de 20 ppm, tolerancia MS/MS de 0,1 Da, cargas peptídicas 2 + 3+ y 4+, con búsqueda tolerante a errores incluida. Se seleccionaron péptidos con ≥2 fragmentos trípticos, puntuaciones de péptidos individuales >60 y un umbral de significancia <0,05.

Para MALDI-TOF-MS, se detectó 1 μL de cada muestra junto con 2 μL de solución diluida de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) (solución de trabajo almacenada como una solución saturada de acetona y diluida 1 en 10 con una solución de etanol/acetona/agua [6:3:1] y 0,1 % de TFA) sobre un objetivo de acero pulido. Las muestras se analizaron en un timsTOF fleX MALDI-2 (Bruker) operado en modo TIMS desactivado (o solo QqTOF), controlado mediante TIMS Control 3.1.13.0. Se realizaron análisis de modo positivo en m/z de 1000 a 10 000, 10 000 disparos con una frecuencia de repetición del láser de 10 000 Hz. La calibración se realizó utilizando una única mancha de CHCA con una mezcla de calibración de péptidos de Bruker e insulina humana recombinante. Los datos se adquirieron utilizando timsControl 3.1.4 y se visualizaron utilizando Data Analysis 6.0 (ambos Bruker). Los mapas de calor en la Figura 8 complementaria se crearon utilizando Prism 9.4.1 (GraphPad).

Las secuencias de aminoácidos de precursores de longitud completa se alinearon utilizando el método de alineación iterativa emparejada local (L-INS-i) en MAFFT 7.50481, y la calidad de las alineaciones se verificó manualmente. La historia evolutiva de la superfamilia O1 se reconstruyó mediante un enfoque filogenético molecular. El modelo evolutivo más apropiado se determinó en PhyML 3.0 utilizando una prueba de criterio de información de Akaike82. Luego se utilizó IQ-TREE 2.2 para reconstruir filogenias moleculares mediante máxima verosimilitud y los valores de soporte de ramas se estimaron mediante arranque ultrarrápido utilizando 10 000 réplicas83,84. Debido a que no se pudieron designar grupos taxonómicos externos, utilizamos el enraizamiento de punto medio para enraizar los árboles.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las lecturas de secuenciación sin procesar se han depositado en el NCBI Sequence Read Archive (SRA) con el número de acceso de BioProject PRJNA943605. Las secuencias precursoras de conotoxina se han depositado en NCBI GenBank [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore] con números de acceso OQ644315–OQ644445. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD042133. Los datos sin procesar para la morfometría del diente radular, el análisis de componentes principales y la proteómica están disponibles como Datos complementarios 1, 3 y 4, respectivamente.

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Los autores desean agradecer a Richard Webb (Centro de Microscopía y Microanálisis, UQ) por su hábil ayuda con la histología y la microscopía electrónica; Alun Jones (IMB Proteomic Facility, UQ) y Amanda Nouwens (Facultad de Química y Biociencias Moleculares, UQ) por su asistencia técnica con LC-MS; Brett Hamilton (Centro de Microscopía y Microanálisis, UQ) por su ayuda con MALDI-MS; Ian Ross (IMB, UQ) por su experiencia relacionada con el cultivo de algas y por compartir equipos e instalaciones, la Facultad de Ciencias Biomédicas Core Imaging Facilities (UQ) por brindar capacitación sobre el software Amira 2021.1 y los Recursos Biológicos de la Universidad de Queensland para el pez cebra y el caracol cono. agricultura. Este trabajo fue apoyado por una subvención Discovery del Consejo Australiano de Investigación (ARC) (DP200103087) (RJL).

Instituto de Biociencia Molecular, Universidad de Queensland, Brisbane, 4072, QLD, Australia

Aymeric Rogalski, SWA Himaya y Richard J. Lewis

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AR & RJL concibieron el proyecto y diseñaron experimentos. AR llevó a cabo cultivos de animales y algas, histología, microscopía, reconstrucción 3D asistida por computadora, análisis transcriptómicos, proteómicos y filogenéticos y escribió el primer borrador del manuscrito. SWAH contribuyó a los análisis transcriptómicos y proteómicos y editó el manuscrito. RJL proporcionó financiación e instalaciones de investigación y escribió el manuscrito.

Correspondencia a Richard J. Lewis.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Alexander E. Fedosov y Helena Safavi-Hemami por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Rogalski, A., Himaya, SWA y Lewis, RJ Las adaptaciones coordinadas definen el cambio ontogenético de la caza de gusanos a la caza de peces en un caracol cono venenoso. Nat Comuna 14, 3287 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38924-5

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Recibido: 11 de octubre de 2022

Aceptado: 19 de mayo de 2023

Publicado: 13 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38924-5

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