Perfil bioarqueológico y paleogenómico del inusual entierro neolítico de Grotta di Pietra Sant'Angelo (Calabria, Italia)

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11978 (2023) Citar este artículo

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El entierro neolítico de Grotta di Pietra Sant'Angelo (CS) representa un hallazgo arqueológico único en la prehistoria del sur de Italia. La ubicación inusual de la inhumación a una altitud bastante elevada y lejos de zonas habitadas, la falta de equipamiento funerario y la deposición boca abajo del cuerpo encuentran similitudes limitadas en los sitios italianos contemporáneos. Estos elementos han suscitado interrogantes más amplios sobre las costumbres mortuorias durante la prehistoria del sur de Italia. Este caso atípico requiere un enfoque interdisciplinario destinado a construir un perfil bioarqueológico integrado del individuo. La investigación paleopatológica de los restos esqueléticos reveló la presencia de numerosos marcadores que podrían estar asociados con actividades artesanales, lo que sugiere posibles interpretaciones del estilo de vida del individuo. Los análisis de TC realizados en los huesos maxilares mostraron la presencia de un tipo peculiar de desgaste dental, pero también una buena densidad de la matriz ósea. Los análisis biomoleculares y micromorfológicos del cálculo dental resaltan la presencia de un rico microbioma oral de tipo neolítico, cuya composición es consistente con la presencia de patologías. Finalmente, los datos paleogenómicos obtenidos del individuo se compararon con poblaciones mediterráneas antiguas y modernas, incluidos datos inéditos de alta resolución de todo el genoma de 20 habitantes modernos del cercano pueblo de San Lorenzo Bellizzi, que proporcionaron información interesante sobre el paisaje biodemográfico del Neolítico. en el sur de Italia.

A finales del sexto milenio a. C., las formas de vida neolíticas están bien establecidas en el sur de Italia (SI)1. La cerámica aparece en el registro arqueológico de las fases del Neolítico Temprano y Medio en Apulia, Basílicata y Calabria; el sistema económico de caza-recolección comienza a ser reemplazado por la expansión de las actividades agrícolas, aunque no se produce un cambio completo hacia una estrategia de subsistencia basada en la agricultura antes de la Edad del Bronce2. Se pueden observar cambios radicales en las estrategias de asentamiento durante las fases del Neolítico Temprano y Medio en SI, basadas principalmente en la ocupación de áreas costeras y subcosteras, como Favella di Corigliano (CS), que representa una de las aldeas agrícolas más antiguas de Italia, y una de las primeras industrias alfareras de Europa Centro-Occidental3. Por el contrario, las evidencias de presencia humana en los territorios interiores de SI son esporádicas hasta las fases avanzadas del Neolítico. En tal contexto, el sitio arqueológico de Grotta di Pietra Sant'Angelo representa un unicum para la explotación humana de SI durante el Neolítico.

Pietra Sant'Angelo es un extenso macizo calizo situado en la vertiente calabresa del Parque Nacional del Pollino (Fig. 1a), en el municipio de San Lorenzo Bellizzi (Cosenza). El macizo es extremadamente rico en cavidades, con al menos 21 cuevas verticales y horizontales estudiadas en la zona. Entre ellas, la Grotta di Pietra Sant'Angelo conserva la evidencia más antigua de actividad humana en el norte de Calabria4. La ubicación de la cavidad (Fig. 1b) a una altitud bastante alta (> 1000 m snm) y no fácilmente visible desde el valle, le ha permitido sobrevivir a las perturbaciones post-deposicionales. La reconstrucción estratigráfica del yacimiento arqueológico atestigua un uso constante de la pequeña cavidad (menos de 20 m de longitud) a lo largo del Neolítico, como lo sugiere la presencia de cerámica tricrómica, bicromía e impresa, mientras que los escasos y esporádicos testimonios de una cerámica más reciente Se ha atestiguado la frecuentación.

(a) Ubicación geográfica de San Lorenzo Bellizzi. Los mapas se obtuvieron del proyecto National Geologic Map Database (https://ngmdb.usgs.gov/topoview/) y se ajustaron con Adobe Illustrator 2022 v3.0 (disponible en https://www.adobe.com/products/illustrator/ ); (b) macizo de Pietra Sant'Angelo y entrada de la cueva homónima (círculo negro); (c) planimetría de la cueva y ubicación del entierro (cuadrado rojo); la extensión de las excavaciones está resaltada en verde; (d) los restos esqueléticos del individuo encontrados dentro de la cueva; (e) las mandíbulas intactas del individuo; fotografías tomadas por Felice Larocca (b, d) y Alessandra Cinti (e).

Las excavaciones arqueológicas realizadas desde 2017 revelaron la presencia de un único enterramiento situado a pocos metros de la entrada de la cavidad (Fig. 1c). Los restos esqueléticos (Fig. 1d) se encontraron dentro de un pozo ovular directamente excavado en el suelo: el individuo enterrado (SLB en adelante) fue encontrado boca abajo, orientado de E a W, con la cara vuelta hacia el suelo y en una posición extremadamente contraída; piedras de tamaño mediano cubrían el cráneo y el lado derecho del cuerpo, con piedras más pequeñas sobre la pelvis, el tronco y las extremidades. A pesar de una constante presencia antropogénica en la cueva, marcada por evidencia de fragmentos de cerámica asociados con las facies Diana y Serra d'Alto5, la cueva no arrojó más signos de actividad funeraria. La falta de equipamiento funerario, junto con el uso de una sencilla fosa en el interior de una cueva, propició una contextualización neolítica del enterramiento. Esto fue confirmado posteriormente mediante análisis de radiocarbono, que ubicaron a SLB dentro del Neolítico Medio (6092 ± 45 BP; 5207–5048 cal BCE, 19,1%/5084–4899 cal BCE, 74,8%/4864–4853 cal BCE, 1 ,5%)6. Sin embargo, el individuo de Grotta di Pietra Sant'Angelo representa una excepción interesante en el paisaje funerario del Neolítico italiano: las inhumaciones únicas, durante las fases más tempranas y más avanzadas del Neolítico en SI, se encuentran generalmente dentro del área doméstica, con el cuerpo acostado de lado, en su mayoría enterrado en fosas directamente excavadas en el suelo o dentro de silos y nichos7,8,9. A lo largo del Neolítico se pueden encontrar evidencias de deposiciones mortuorias lejos de áreas habitadas en contextos funerarios propios de Apulia, como necrópolis10 y cavidades funerarias11,12. Sin embargo, considerando la ubicación de la cueva y los problemas que plantea el acceso a ella, debido a la presencia de escarpados riscos verticales, este enterramiento constituye un único marcador arqueológico de presencia humana neolítica en las montañas de SI. Además, la ubicación inusual del entierro dentro de la cueva, ubicada a sólo unos metros de la entrada y parcialmente expuesta a la luz natural, plantea interrogantes sobre los hábitos funerarios de los humanos neolíticos en SI y, más específicamente, sobre la historia de vida del individuo. Nos preguntamos si la ascendencia genética, el estado de salud, la ocupación o la identidad social podrían estar relacionados de alguna manera con el entierro no convencional. Un enfoque metodológico bien establecido que combina arqueología biomolecular, antropología física y arqueotanatología13,14,15,16 pudo proporcionar respuestas a algunas de estas preguntas y nos ayudó a reconstruir un perfil bioarqueológico casi completo del individuo. Las investigaciones antropológicas y paleopatológicas de los restos se han complementado con tomografía computarizada de la mandíbula y el maxilar (Fig. 1e). La presencia de cálculo dental ha permitido caracterizar los microdesechos atrapados en la matriz mineral, así como recuperar información de interés sobre la composición del microbioma bucal y el potencial estado de enfermedad gracias a la combinación de análisis metagenómicos y paleoproteómicos. Finalmente, se ha producido un genoma mitocondrial completo y los primeros datos del genoma completo de la Calabria prehistórica mediante secuenciación escopeta. De hecho, si bien se han aplicado enfoques de ADN antiguo para investigar la transición neolítica en el norte17,18,19, el centro20 y la Italia insular21,22,23, todavía se han producido pocos datos de ADN antiguo para el SI prehistórico24,25,26 y muy pocos Se sabe mucho sobre el paisaje paleogenómico de Calabria27. Por tanto, los datos genómicos obtenidos aquí se investigaron en el contexto de la variabilidad moderna y antigua de las poblaciones mediterráneas. Para mejorar nuestra comprensión de la dinámica de la población, se recolectaron muestras de 20 individuos autóctonos modernos de la aldea de San Lorenzo Bellizzi y se genotiparon aproximadamente 720.000 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en todo el genoma.

Los restos óseos del individuo fueron encontrados en posición muy contraída, con el torso boca abajo, el rostro apoyado en el fondo de la fosa, con los codos y las rodillas flexionados; ambos antebrazos fueron colocados debajo del cuerpo, con los miembros inferiores reagrupados en el lado derecho y dispuestos con las piernas hiperflexionadas sobre los muslos. La mandíbula y el maxilar se encontraron en total oclusión. El carácter primario del depósito ha sido definido por la correcta disposición anatómica de los elementos esqueléticos y por la persistencia de conexiones lábiles; la ausencia de disyunción de los espacios vertebrales, el mantenimiento del volumen de la caja torácica y la conexión anatómica de los huesos de las manos y los pies sugieren que la descomposición ocurrió en una fosa llena28. El individuo, un varón adulto de ± 30 años de edad, aproximadamente 164 cm ± 3 cm de altura, mostró patrones de desgaste extremo en los dientes (Fig. 2a), involucrando la pérdida completa de la altura de la corona en los incisivos inferiores. El esmalte dental está casi ausente de la superficie oclusal, dejando una superficie dentinaria casi continua rodeada por un borde parcial de esmalte y provocando una reducción notable en el tamaño del diente.

(a) porción mandibular de las mandíbulas con formas extremas visibles de patrones de desgaste; (b) imágenes estereomicroscópicas de las superficies oclusales de los incisivos y caninos inferiores, con evidencia clara de estrías (abajo y central) y fracturas (arriba); (c) Imágenes de TC de las mandíbulas.

Numerosas rayas fueron visibles mediante estereomicroscopía en todas las direcciones en las superficies oclusales de los incisivos y caninos inferiores (Fig. 2b), así como fracturas de corona y signos de astillas en los dientes mandibulares y maxilares anteriores. Se presenta un desgaste oblicuo más pronunciado en la superficie lingual de los dientes superiores y en la superficie bucal de los dientes mandibulares (fricción), junto con signos de desgaste en la superficie del diente (abrasión), particularmente evidente en los primeros molares inferiores y superiores. ; También son visibles astillas y fracturas de las coronas de los dientes posteriores (molares). Hay recesión difusa del hueso alveolar y exposición de las raíces dentales, así como una pérdida intravitamínica del segundo premolar derecho superior, probablemente después de un absceso dentro del hueso alveolar. También se identificaron pequeñas cantidades de cálculo en las superficies de los dientes.

La investigación por TC de los maxilares (Fig. 2c) informó una buena densidad de la matriz ósea, acorde con la edad del individuo; Se observa una absorción ósea generalizada a nivel alveolar, lo que indica la presencia de una enfermedad periodontal que podría haber provocado la pérdida del segundo premolar superior. Las relaciones entre los dos huesos de la mandíbula muestran un deslizamiento hacia adelante de la mandíbula inferior (clase III) en el cierre de cabeza a cabeza de los incisivos. Nos permite estimar una posición original del maxilar inferior (en clase I) que cambió con el tiempo debido a la falta de estabilidad oclusal mandibular y maxilar.

Respecto al esqueleto poscraneal, se observaron patrones anormales de formación o destrucción ósea a nivel de las articulaciones. Se han detectado osteofitos marginales moderados en la extremidad superior derecha e izquierda (epífisis proximal del cúbito derecho y epífisis distal del radio derecho e izquierdo) y en la cintura pélvica (acetábulo izquierdo). Se observaron superficies deprimidas con bordes lisos en la superficie distal derecha de la tróclea humeral (10 mm de largo), en la superficie posterior de los huesos naviculares tarsianos izquierdo y derecho (aproximadamente 3 mm de largo) y en la primera falange proximal del dedo derecho (cóncal). faceta proximal, 10 mm de largo). Tales patrones son típicos de la osteocondritis disecante, una condición patológica del hueso subcondral que sostiene el cartílago de las articulaciones sinoviales, que consiste en el desprendimiento parcial o completo del cartílago articular del hueso subcondral29. Se identificaron patrones de formación y destrucción ósea anormal en los ejes. Es visible una periostitis inespecífica en la parte media de las tibias y el peroné, y hay formaciones óseas anormales moderadas en forma de entesopatías, que afectan la superficie inferior de ambas clavículas en la unión del ligamento de la apófisis conoides y los sitios de los tendones flexores. en la superficie palmar de las falanges proximales de la mano. Son evidentes surcos ovalados intensos a lo largo de la superficie inferior de la clavícula derecha en la unión del ligamento costoclavicular (fosa romboidea); en la clavícula izquierda la lesión aparece como una depresión moderada (entesopatías), mientras que en la diáfisis humeral superior hay una depresión moderada en la inserción del músculo pectoral mayor. También se han detectado formas óseas anormales, lo que implica una probable fractura en tallo verde de la clavícula derecha y una inclinación hacia atrás de la meseta tibial.

Finalmente, se produce una extensión lateral de la superficie articular de la cavidad glenoidea derecha en la inserción del labrum glenoideo inferior; no hay osificación de ligamentos ni inserción de tendones, ni tampoco osteofitos, lo que indica una posible inestabilidad o flexibilidad de la articulación del hombro. Las facetas en cuclillas están presentes en la superficie anterior de la tróclea del astrágalo y en el margen anterior del extremo inferior de la extensión tibial, lo que indica un contacto habitual entre los dos elementos anatómicos29.

El análisis de microrestos de cálculo dental reveló la presencia de una variedad de microrestos de mal diagnóstico (Información complementaria). La mayoría de ellos eran de origen vegetal y consistían en gránulos de almidón (Figura complementaria 2A), tejidos vegetales (Figura complementaria 2B), un tricoma (pelo vegetal, Figura complementaria 2C), pero en la mayoría de los casos ni siquiera se podían asignar. a nivel familiar. Dos de los restos de plantas recuperados coincidían con fibras (Figuras complementarias 2D, E), pero también eran de baja naturaleza diagnóstica. Las partículas de color marrón oscuro (Figura complementaria 2G) podrían ser evidencia de microcarbón, pero también carecían de características distintivas seguras, por lo que fueron descritas como "escombros quemados", para reconocer su naturaleza incierta. También había arena mineral (Figura complementaria 2F), pero la microscopía óptica por sí sola no permite la identificación de dichos restos y será objeto de análisis futuros. A pesar del mal diagnóstico de los restos, sugieren el consumo de alimentos ricos en almidón y cultivos de hojas. La presencia de restos como fibras y arenillas minerales, que pueden haber contribuido al desgaste dental del individuo, también podría estar asociada a la actividad ocupacional. Sin embargo, la cantidad muy limitada de fibras textiles potenciales y su identificación insegura dificultan una interpretación clara. De hecho, también se pueden encontrar fibras en muestras de cálculo donde no se reportan patrones de desgaste dental30, por lo que se debe extremar la precaución en la interpretación de estos restos.

Se realizó un análisis paleogenómico del cálculo dental para definir la antigua comunidad microbiana oral de SLB. Se construyeron bibliotecas genómicas monocatenarias a partir de antiguos extractos de ADN de cálculos dentales y se secuenciaron en la plataforma Illumina HiSeq X, produciendo 7.695.982 lecturas de extremos emparejados. Aplicamos HOPS31, una herramienta específicamente concebida para la caracterización taxonómica de datos metagenómicos de lectura corta. Se han identificado varias bacterias asociadas al huésped en el cálculo dental, entre las que están presentes diferentes miembros de los géneros Treponema, Prevotella, Streptococcus y Methanobrevibacter (en la Tabla complementaria S1 se presenta una lista con las 50 especies microbianas más abundantes identificadas en el cálculo dental). ). Como se esperaba para las muestras de cálculos dentales, también se detectaron miembros de géneros bacterianos asociados tanto con el huésped humano como con el medio ambiente (p. ej., Actinomyces spp., Streptomyces sp. y Pseudomonas spp.). El origen antiguo se validó evaluando el número de lecturas para cada taxón específico, la puntuación de degradación post mortem (PMDS), la puntuación de proporción de diferencia negativa (−Δ%) y la presencia de un patrón de desaminación CT. Los taxones con más de 300 lecturas asignadas, más de 50 lecturas con PMDS > 1, − Δ % > 0,9 y que muestran patrones de transición CT en 5 ′ se consideraron de origen antiguo (Tabla complementaria S1) Una gran cantidad de lecturas asignadas a Los taxones orales humanos previamente identificados mantuvieron perfiles de desaminación y sustitución que son consistentes con el ADN antiguo (p. ej., Treponema denticola, Actinomyces dentalis, Streptococcus gordonii, Methanobrevibacter oralis, Porphyromonas gengivalis, Prevotella intermedia). De las especies recuperadas, Treponema denticola, Tannerella forsythia y Porphyromonas gingivalis constituyen el agregado más patógeno de bacterias orales, a saber, el “complejo rojo”, que se reconoce que está fuertemente asociado con la enfermedad periodontal32,33. La aparición de estas tres especies en términos de número de lecturas (Tabla S1) está en línea con la abundancia esperada, como se destaca en otros estudios34. Los metagenomas orales detectados a partir del cálculo dental se compararon en el Análisis de Coordenadas Principales (Fig. 3) con datos de microbiomas orales antiguos disponibles del Neandertal (n = 14, verde), preagrícola (n = 51, naranja), Neolítico (n = 16). , amarillo), preantibióticos (n = 15, azul) y moderno (n = 18, azul claro)35,36. En particular, 16 de estos metagenomas pertenecen a antiguos individuos italianos que coinciden geográfica y temporalmente con nuestra muestra. El microbioma oral de SLB (punto rojo) se encuentra cerca de muestras de origen neolítico/preagrícola, lo que indica un importante intercambio de taxones con microbiomas de este período, como se esperaba por la edad de la muestra. Para investigar más a fondo el componente metagenómico del individuo, también se analizaron secuencias de ADN antiguas generadas a partir de la dentina dental de SLB (ver sección “ADN humano antiguo”) para detectar los patógenos bacterianos más comunes, como lo sugiere la literatura37,38. Según nuestros hallazgos, no se encontraron rastros de ADN de patógenos potenciales (Tabla complementaria S2). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que es posible que el ADN del patógeno no se haya conservado a lo largo del tiempo en la dentina debido a la conformación y el grosor de las diferentes paredes celulares bacterianas39 o porque algunos patógenos no ingresan al torrente sanguíneo y probablemente sean indetectables40. Además, nuestro análisis está completamente ciego a los virus, especialmente a los virus de ARN, cuyo material genético apenas se conserva en muestras antiguas, y hasta ahora se han publicado pocos intentos de secuenciar transcriptomas antiguos41.

Análisis de coordenadas principales (PCoA) del contenido del microbioma oral antiguo para SLB (rojo) y 114 muestras del período neandertal (verde), preagrícola (naranja), neolítico (amarillo), preantibiótico (azul) y humanos modernos. (azul claro). Las elipses indican las áreas de confianza del 95% basadas en el error estándar de las medias de distancias entre muestras del mismo grupo.

La paleoproteómica de una pequeña muestra de cálculo dental arrojó 1309 aciertos de proteínas únicos (conjunto de datos complementarios). Entre estos, 27 pertenecen al huésped (Tabla complementaria S3) y la mayoría (20) están asociados con el sistema inmunológico innato (Figura complementaria S3). Otros están relacionados con la hemostasia, el metabolismo de las proteínas y la digestión del carbonato de la dieta (amilasas). La mayoría de las proteínas identificadas eran de origen bacteriano (1271). El análisis de la composición taxonómica del microbioma antiguo se complica por el hecho de que la misma secuencia peptídica puede encontrarse en varios taxones, lo que da lugar a múltiples coincidencias. No obstante, considerando los taxones que produjeron el mayor número de aciertos de proteínas, Arachnia spp., Actinomyces spp., Streptococcus spp., Fusobacterium spp., Corynebacterium spp., Olsenella spp. y Ottowia spp. son los más representados. Todos estos taxones son componentes del microbioma oral central saludable (eHOMD https://www.homd.org, consultado el 01/11/2023). La presencia de Treponema spp. y Tannerella spp., presente entre las bacterias del “complejo rojo”, se confirma también a partir del proteoma. Otras bacterias de interés potencial incluyen Aggregatibacter spp., Cardiobacterium spp. y Eikenella corrodens, componentes habituales de un microbioma sano, pero que, en casos raros, pueden ser la causa de endocarditis infecciosa42.

Se extrajo ADN antiguo de un molar de SLB para comprobar la persistencia del ADN endógeno y proporcionar un perfil genético del individuo. Los extractos se convirtieron en bibliotecas genómicas monocatenarias y se secuenciaron para un total de 531 millones de lecturas en la plataforma Illumina HiSeq-X Ten. El ADN endógeno recuperado informó una cobertura de todo el genoma de 0,24X, con > 290.000 SNP superpuestos al 1240 K—Human Origins SNP Array v54.1 (https://reich.hms.harvard.edu/allen-ancient-dna-resource -aadr-genotipos-descargables-datos-de-adn-actuales-y-antiguos). Los patrones de desaminación entre las secuencias fueron consistentes con la edad de la muestra (Figura complementaria S4), y se excluyó la presencia de contaminación moderna tanto en el cromosoma X (6%) como en el nivel mitocondrial (2%) (Tabla complementaria S4). . Se reconstruyó un genoma mitocondrial 39 veces completo a partir del individuo, reportando 33 variantes únicas en comparación con el rCRS. El haplogrupo mitocondrial ha sido asignado con un 99% de precisión al haplogrupo K1a + 195. El haplogrupo del cromosoma Y se identificó como G2a2a1 comparando lecturas de SLB de alta calidad con una lista informativa de SNP del cromosoma Y (https://isogg.org/tree/). Tanto la relación de cobertura X/autosomas como la relación de cobertura Y/cromosomas sexuales sugieren que el individuo es masculino, lo que confirma el resultado de la investigación antropológica. Se reconstruyó un árbol filogenético (Fig. 4a) para investigar la agrupación del individuo en el paisaje de linajes mitocondriales prehistóricos relacionados con K y los grupos de SLB en proximidad con otros K1a + 195, en particular con un individuo del asentamiento neolítico de Makotrasy. (I14173, cultura Baalberge, República Checa) fechado entre 4300 y 3500 a. C. Curiosamente, el MJN realizado para la variabilidad mitocondrial muestra que SLB está a pocos nodos lejos de otro individuo prehistórico de Italia relacionado con K1, el Iceman43, cuyo raro haplogrupo mitocondrial se ha identificado solo dentro del área de los Alpes (Figura complementaria S5).

(a) La reconstrucción filogenética de linajes mitocondriales antiguos relacionados con K muestra que SLB cae en la variabilidad del haplogrupo K1a + 195 (verde oliva); (b) Proyección PCA del individuo SLB en la variabilidad del antiguo Neolítico italiano y mediterráneo; (c) la distribución de linajes del cromosoma Y relacionados con G2a en la antigua Europa entre 8000 y 2500 a. C. (izquierda) y 2500 a. C.-1500 d. C. (derecha). SLB se muestra en un cuadrado rojo. Datos genómicos tomados del David Reich Lab Allen Ancient DNA Resources v54.1. Los mapas se obtuvieron del proyecto National Geologic Map Database (https://ngmdb.usgs.gov/topoview/) y se ajustaron con Adobe Illustrator 2022 v3.0 (disponible en https://www.adobe.com/products/illustrator/ ); (d) cuando se proyecta en la variabilidad de los italianos modernos, SLB (punto azul) se agrupa muy cerca de los italianos modernos del sur (puntos amarillos), pero no se superpone con ellos.

Bajo una perspectiva poblacional diacrónica y geográfica, comparamos nuestra muestra con poblaciones antiguas y modernas mediante análisis de componentes principales. La proyección PCA sobre un conjunto de datos de muestras antiguas muestra cómo SLB cae en la variabilidad del Neolítico italiano y mediterráneo, cerca de los individuos del Neolítico del Peloponeso y Anatolia (Fig. 4b).

Luego, el individuo SLB se proyectó en un conjunto de datos de 737 italianos modernos (Fig. 4d), representativos de la variabilidad genética de Italia (consulte la sección "Material y métodos"), fusionados con datos genómicos inéditos obtenidos de 20 habitantes modernos del municipio cercano. de San Lorenzo Bellizzi. La agrupación geográfica de las muestras revela un claro gradiente latitudinal a lo largo de la península, donde el grupo sardo está claramente separado del resto. Los habitantes modernos de San Lorenzo Bellizzi se agrupan, muy cerca del grupo de control del sur de Italia, pero no se superponen con él; en cambio, aparecen separadas del resto de las muestras modernas, lo que indica un posible aislamiento y un posterior efecto de deriva genética. A pesar de estar geográficamente cerca, el individuo SLB del Neolítico no entra dentro de la variabilidad de los grupos modernos, dentro de la de los habitantes modernos de San Lorenzo Bellizzi, ni dentro de la variabilidad genética del Sur.

La Grotta di Pietra Sant'Angelo se encuentra a gran altura, sobre un peñasco vertical de difícil acceso. A pesar de las numerosas cavidades que se han estudiado en la zona del macizo rocoso, ésta es la única en la que hasta el momento se ha identificado la presencia de actividades funerarias neolíticas. Las características tipológicas del enterramiento encontrado en el interior de la cueva lo designan como un hallazgo notable para la prehistoria del sur de Italia. Se pueden encontrar tipos similares de deposición, con un solo individuo enterrado en posición boca abajo y acurrucado, con la cara vuelta hacia el suelo, en Palata di Canosa44, Pulo di Molfetta45 y Titolo di Bari-Palese9, tres sitios de Apulia que datan de la Antigua y Neolítico Medio. Cabe señalar, sin embargo, que estos entierros se encuentran en contextos funerarios típicos, dentro o en las proximidades de los pueblos. Si uno considera (1) la evidencia tipológica más general de enterrar al difunto en una posición acurrucada dentro de la fosa, (2) la presencia generalizada de piedras de cobertura y (3) la ausencia total de equipo funerario, se pueden encontrar más similitudes con el entierro infantil de la Grotta di San Michele en Saracena46 y en el área funeraria del pueblo neolítico de Favella3. Sin embargo, los significados sociales que subyacen al comportamiento funerario heterodoxo expresado en Grotta di Pietra Sant'Angelo son difíciles de abordar. En comparación con otros contextos arqueológicos similares en el norte de Calabria Jónica, como las cercanas cuevas de Cassano allo Ionio47, la ausencia de más restos humanos sugiere que Grotta di Pietra Sant'Angelo tuvo un papel marginal como lugar de enterramiento durante el Neolítico Medio. Además, la contracción extrema del cuerpo dentro de la fosa propone dos escenarios interpretativos: una fragilidad crítica del sujeto, que podría haber permitido flexionar fácilmente los miembros inferiores; la posible presencia de cuerdas que mantenían las extremidades juntas. La disposición del cuerpo con piedras que cubren toda su extensión podría estar asociada al objetivo práctico de bloquear el cuerpo en posición tumbada. Además, la posición completamente antinatural de los miembros superiores y de las manos también podría indicar que el cuerpo ha sido dispuesto en esa posición durante el entierro, ya sea en un momento cercano a la muerte, o en una fase posterior de al menos 24 a 36 horas. , es decir, el tiempo necesario para que cese el rigor mortis48. A pesar de la falta de elementos antropológicos que puedan estar directamente relacionados con la causa de la muerte, varias características esqueléticas identificadas mediante investigación macroscópica permiten hacer algunas consideraciones sobre el estilo de vida del individuo. El análisis del esqueleto poscraneal proporciona información relacionada con microtraumatismos agudos o moderados repetidos en hombros (sospecha de fractura en tallo verde, entesopatías), miembros superiores (osteofitos, osteocondritis disecante, entesopatías), cintura pélvica y miembros inferiores (osteofitos, periostitis, osteocondritis). disecante). Estas alteraciones podrían estar relacionadas con un estrés biomecánico general sobre huesos y articulaciones que también podría generar inflamación ósea periférica aespecífica en los miembros inferiores29,49. Además, las facetas bilaterales en cuclillas de la tibia y el astrágalo y la inclinación hacia atrás de la meseta tibial se han tomado como evidencia de hiperflexión en las articulaciones de la cadera y la rodilla e hiperdorsiflexión en el tobillo y las articulaciones subastragalina; Estos marcadores articulares están relacionados con el uso habitual de la posición en cuclillas durante la vida, así como con el estar de pie y caminar durante mucho tiempo sobre superficies duras/impermeables50,51,52 y/o con rasgos genéticos53. En general, la remodelación esquelética inducida por el estrés que involucra diferentes huesos de manera moderada sugiere que una variedad de actividades físicas repetidas podrían haber desempeñado un papel en el estilo de vida del individuo. El análisis del desgaste dental aporta evidencia del uso de la boca con fines no alimentarios, como herramienta inespecífica o "tercera mano". Las formas extremas de patrones de desgaste de los incisivos inferiores y la presencia de microsurcos en las superficies oclusales se han tomado como evidencia de actividades extramasticatorias y la reducción en el tamaño de los dientes se ha descrito en la literatura como el resultado de los efectos combinados de desgaste oclusal e interproximal54,55. Se han observado patrones de desgaste dental de tipo masticatorio atribuibles a la fricción y abrasión en los dientes posteriores, aunque el desgaste asimétrico (más prominente en el lado derecho) podría ser un elemento diagnóstico relacionado con actividades como la preparación de alimentos o el procesamiento de materiales duros. o materiales resistentes. Además, los microdesechos identificados mediante investigación morfológica confirman la utilización de la boca con fines no alimentarios. No se encontraron elementos diagnósticos relacionados con la dieta, pero la presencia de minerales y fibras magentas podría estar asociada con el uso de la boca como tercera mano durante la elaboración de objetos artesanales. Si bien es difícil vincular estas fibras de forma segura a una actividad artesanal, la presencia de un marcado desgaste dental en los dientes de SLB y la presencia de fibras podrían ser un indicio de alguna artesanía basada en fibras. Esta evidencia ha sido atestiguada en otros contextos funerarios coetáneos en SI, como Serra Cicora en Apulia, y asociada al empleo de la boca como herramienta de trabajo10.

Entre las patologías dentales detectadas, se han tomado como evidencia de masticación de partículas duras, desconchones y fracturas de las coronas de los dientes56,57. Finalmente, la recesión difusa del hueso alveolar y la exposición de las raíces dentarias se han relacionado con la inflamación de los tejidos blandos (enfermedad periodontal, gingivitis)58. Esta evidencia paleopatológica concuerda con los datos biomoleculares obtenidos del cálculo dental.

Los análisis paleoproteómicos del cálculo mostraron la presencia de un rico microbioma oral, dominado por taxones bacterianos que se encuentran comúnmente en la placa y la cavidad bucal. La autenticidad de las secuencias de péptidos no humanos, que podrían indicar la presencia de proteínas dietéticas (p. ej., colágeno de Bos taurus), no se puede establecer firmemente y, por lo tanto, no se intenta ninguna interpretación adicional. Los datos del metaproteoma son consistentes con los análisis metagenómicos, mostrando la presencia de Actynomyces y Streptococcus, así como de Treponema y Tannerella spp., siendo este último típico de la enfermedad periodontal. En particular, el análisis metagenómico destacó la persistencia de las bacterias Gram negativas Treponema denticola, Tannerella forsythia y Porphyromonas gingivalis, que forman parte del llamado “complejo rojo”, conocido por estar fuertemente asociado con la enfermedad periodontal32,33, pero también a un mayor riesgo de desarrollar cáncer de esófago59,60, diabetes mellitus61,62, y se proponen como factor de riesgo para otros síndromes63,64. Entre las bacterias de potencial interés detectadas, Aggregatibacter spp., Cardiobacterium spp. y Eikenella corrodens, que suelen formar parte de un microbioma “sano”, podrían, en raros casos, estar asociadas con el desarrollo de endocarditis infecciosa42. La presencia de patologías dentales y la detección de amilasas están perfectamente en consonancia con el consumo de una dieta rica en hidratos de carbono, típicamente neolítica. La proteómica también puede detectar la respuesta inmune del huésped, y se observaron varias proteínas humanas, incluidos numerosos componentes del sistema inmunológico innato, por ejemplo, desgranulación de neutrófilos y péptidos antimicrobianos (Figura complementaria S3). Esto proporciona la confirmación a nivel molecular de que el individuo había sufrido infecciones durante su vida65,66,67,68.

Debido a la mala conservación de los restos durante la investigación arqueológica, el individuo fue identificado inicialmente como una mujer4. Sin embargo, los datos de ADN antiguo y los análisis de laboratorio de los restos esqueléticos llevaron a una identificación indudable del individuo como un varón, confirmando el resultado de una investigación antropológica reciente6. La proyección PCA de los datos genéticos en el conjunto de datos de muestras antiguas muestra cómo SLB cae en la variabilidad del Neolítico italiano y mediterráneo, cerca del Neolítico del Peloponeso y Anatolia. Esta firma genética neolítica encuentra apoyo en los haplogrupos uniparentales recuperados de SLB: tanto las ramas K1a del ADN mitocondrial como los sublinajes del cromosoma Y G2a han sido indicados como parte del componente genético neolítico que llegó al continente europeo hace 8000 años, con sublinajes G2a. -Los haplogrupos son los linajes uniparentales más ampliamente distribuidos entre los europeos del Neolítico69,70 (Fig. 4c). En comparación con las poblaciones modernas, SLB cambia en las proximidades del grupo sardo, que se ha informado que conserva la mayor proporción de ascendencia neolítica entre todas las muestras italianas71,72,73,74. Sobre la base de datos modernos, se ha propuesto que la prehistoria genética de SI es el resultado de eventos migratorios diferentes de los que dieron forma a la ancestralidad de Europa central y oriental, con vínculos genéticos mediterráneos entre las poblaciones del Egeo y SI que se remontan al Neolítico. período75,76. Las contribuciones genéticas que vincularon a SI con las islas griegas y Anatolia han sugerido la posibilidad de que el Mediterráneo haya servido como encrucijada complementaria para los eventos migratorios ocurridos durante el Neolítico77, aunque tal posibilidad no puede ser explorada en su totalidad con un solo individuo de Calabria. Sin embargo, el panorama paleogenómico de la SI prehistórica está lejos de comprenderse y se necesitan nuevos datos para comprender mejor el legado de las antiguas migraciones en esta región. Los resultados paleogenómicos presentados en este trabajo ciertamente se ven afectados por el bajo número de SNP utilizados, pero representan otro paso importante para los estudios arqueomoleculares en las regiones del sur de la península italiana.

Los resultados de un estudio tan interdisciplinario nos permitieron reconstruir un perfil bioarqueológico casi completo del individuo. Si la anomalía funeraria expresada en Grotta di Pietra Sant'Angelo podría estar relacionada con prácticas necrofóbicas o rituales, tales teorías no pueden aclararse a través del resultado de esta investigación interdisciplinaria. Sin embargo, parte de la evidencia que reunimos sugiere posibilidades interesantes. La ausencia de rastros de traumatismo en restos óseos y la presencia de bacterias potencialmente relacionadas con enfermedades inflamatorias, combinadas con la detección de proteínas humanas del sistema inmunológico innato, podrían sugerir la persistencia de un estado inflamatorio inespecífico con consecuencias potencialmente fatales. La posibilidad de que el individuo haya muerto lejos de su comunidad explicaría la elección poco ortodoxa de enterrar a la persona en un sitio donde no se han atestiguado funciones mortuorias específicas. A pesar de la falta de un equipamiento funerario claro, el entierro en sí podría definirse como la expresión de un comportamiento social cuidadosamente planificado, especialmente teniendo en cuenta las dificultades que surgen para acceder a la cavidad. El aporte de metodologías geoquímicas como el análisis de isótopos estables, no aplicadas en este estudio, podría ser beneficiosa para comprender mejor la procedencia del individuo. Además, los autores esperan que en un futuro próximo se puedan generar nuevos datos moleculares en Calabria, cuya rica prehistoria merece ser explorada mediante enfoques integrados.

Todos los experimentos realizados para el presente trabajo están de acuerdo con directrices y regulaciones específicas.

El examen de la posición de los huesos se realizó in situ antes del desprendimiento del esqueleto del suelo siguiendo las indicaciones metodológicas de Crubezy et al., 199078 y Duday, 200628. Una investigación antropológica preliminar6 se centró en la evaluación de parámetros biológicos como edad al morir, sexo y estatura; Los datos antropológicos, fueron adquiridos mediante observación morfológica macroscópica y levantamiento métrico de los huesos, según los principales métodos reportados en la literatura79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89.

Se aplicó un análisis paleopatológico del esqueleto para identificar y describir anomalías macroscópicas en huesos y articulaciones, tanto en el esqueleto axial como en el apendicular (Figura complementaria S1). El análisis paleopatológico se realizó mediante inspección directa y tomografía computarizada médica (parámetros de adquisición: espesor de sección de 1,25, intervalo de reconstrucción de 0,6 mm, 120 kV y 100 mA) realizada en la UO de Radiología del Hospital Morgagni Pierantoni de Forlì. Las evaluaciones visuales incluyen la identificación de lesiones patológicas y su distribución dentro de los huesos y articulaciones afectados, y un resumen descriptivo del tipo de características anormales49. El análisis descriptivo puede proporcionar conjuntos de datos importantes para una investigación paleopatológica más profunda.

Se realizó un análisis de microdesechos sobre cálculo dental recuperado del primer incisivo inferior derecho, en el que la presencia de desgaste en la superficie oclusal podría indicar un uso de la boca como una "tercera mano". El protocolo se basó en estudios previos65,90. Tras la extracción del cálculo y una etapa de descontaminación para eliminar elementos provenientes del suelo del entierro, la muestra fue descalcificada en una solución débil de ácido clorhídrico (HCl 0,6 M). Este paso disuelve la matriz inorgánica y extrae todos los microdesechos que se han ido incorporando dentro del cálculo a lo largo de la vida del individuo. La observación de los microdesechos se realizó mediante un microscopio óptico polarizador con luz transmitida. Los portaobjetos se escanearon con un aumento de 160x, 400x, 1000x utilizando un microscopio óptico Leica ICC50 W. Los microdesechos (Figura complementaria S2) se dividieron en morfotipos según la morfología y un nombre, una descripción y una hipótesis sobre el origen y el método de incorporación asignados a cada uno. Cualquier identificación sugerida se basa en sus características anatómicas y en la comparación con material de referencia moderno y textos de referencia clave90,91,92,93,94,95,96,97,98,99.

La preparación de muestras para paleoproteómica se llevó a cabo en el antiguo laboratorio de proteínas ("Arqueobiómica") de la Universidad de Turín, siguiendo directrices internacionales para minimizar la contaminación y garantizar la autenticidad de las secuencias100. En resumen, la muestra (PALTO 247) se pesó (7,6 mg), se lavó en 200 µL de solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 0,5 M, pH = 8) durante diez minutos, luego se desmineralizó en 500 µL de EDT 0,5 M con agitación suave (450 RPM) durante ocho días. La muestra desmineralizada se procesó siguiendo el protocolo SP3 para muestras bajas en proteínas101. Después de la reducción de los enlaces disulfuro con ditiotreitol (solución acuosa 1 M) a 65 °C durante 60 min y la alquilación con yodoacetamida (solución acuosa 0,5 M) a temperatura ambiente durante 45 min, se agregaron 30 μL de Sera-Mag SpeedBeads (mezcla 1:1). de hidrófobos e hidrófilos) a cada uno de los extractos. Para inducir la unión, se añadió EtOH al 100 % (grado HPLC) hasta una concentración final de EtOH del 50 % y se incubó a 24 °C durante 5 minutos a ~1000 rpm. Luego se colocaron los tubos en una rejilla magnética para su separación, se retiró el sobrenadante y se descartó. Las proteínas unidas a las perlas se limpiaron con EtOH al 80% (3X), se cambiaron a tampón (bicarbonato de amonio 50 mM, pH 7,5–8) y la mezcla se sonicó durante 30 s. Después de este paso, se añadió tripsina (0,5 μg, Promega, grado proteómico) para la digestión durante la noche a 37 °C y se aplicó una ligera agitación (~ 1000 rpm). Posteriormente, los extractos se centrifugaron durante 1 min, se colocaron en una rejilla magnética, los sobrenadantes que contenían los péptidos digeridos se transfirieron a tubos separados, se acidificaron con TFA al 10 % (hasta una concentración final de TFA del 0,1 %) y las muestras se purificaron usando sólido C18. Puntas de extracción en fase (Pierce, Thermo-Fisher). Los péptidos eluidos se evaporaron hasta sequedad.

Los análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) se realizaron en el Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud de la Universidad de Copenhague. La muestra de cálculo dental (PALTO 247) fue precedida por un control de laboratorio (concha de molusco antiguo A) y dos blancos de lavado y seguida por un blanco de lavado y un control de laboratorio (control B de concha de molusco antiguo). Los eluatos de péptidos secos se resuspendieron en 30 µl de ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (ACN) al 80 % en agua y se transfirieron a una centrífuga de vacío SpeedVac™ Concentrator (Thermo Fisher Scientific, Dinamarca) a 40 °C hasta que quedaron aproximadamente 5 µl de la solución. . Luego se agregaron a cada pocillo 15 μl de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% y ACN al 5%. Luego, las muestras se separaron en una columna de 15 cm (75 μm de diámetro interior) con láser interno y se empaquetaron con perlas C18 de 1,9 μm (Dr. Maisch, Alemania) en un EASY-nLC 1200 (Proxeon, Odense, Dinamarca) conectado a un Espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific, Bremen, Alemania) en un gradiente de 77 min. Se inyectaron cuatro microlitros de muestra/control. Los parámetros de LC y MS se ejecutaron según el método de cálculo dental de Scorrano et al.102, con la energía de colisión del HCD al 30 %, la lente de RF al 40 % y el tiempo de inyección de MS2 de 54 ms para ajustar las diferencias entre los espectrómetros de masas.

Los datos de espectrometría de masas sin procesar se buscaron en una base de datos combinada de secuencias de proteínas Uniprot (Universal Protein Database, descargada el 12/06/2022) y eHOMD (base de datos ampliada del microbioma oral humano, descargada el 12/06/2022) utilizando el software PEAKS Studio XPro. Los resultados de las búsquedas de Spider realizadas, incluidas todas las posibles modificaciones y sustituciones de aminoácidos, se consideraron para un análisis más detallado. Los umbrales para la identificación de péptidos y proteínas se establecieron de la siguiente manera: puntuación de péptidos − 10lgP ≥ 30, puntuación de proteínas − 10lgP ≥ 40, puntuaciones de secuencias de novo (ALC%) ≥ 80, péptidos únicos ≥ 2. Para garantizar que todas las fuentes de contaminación fueran Considerados, los resultados discutidos aquí se basan en el conjunto de proteínas que quedan después de eliminar todas las proteínas encontradas en los espacios en blanco y el control (los resultados sin filtrar se informan en el Conjunto de datos complementario).

Todo el conjunto de datos también se utilizó para estimar el alcance de la desamidación, tanto general como específica del sitio, utilizando la herramienta DeamiDATE103. Los datos sin procesar de MS se buscaron primero utilizando MaxQuant v.1.6.3.4104 con una base de datos formada por todos los resultados positivos de proteínas de la búsqueda PEAKS. El carbamidometilo (C) se estableció como modificación fija; La oxidación (M), la desamidación (NQ), el ácido piroglutámico (QE) y la hidroxiprolina se establecieron como modificaciones variables. La digestión se realizó con tripsina y se omitieron un máximo de dos escisiones. La tasa de descubrimiento falso (FDR) se estableció en 1% y el límite de puntuación mínimo para péptidos modificados y no modificados fue 50. Todos los demás parámetros se dejaron como predeterminados para los espectrómetros de masas Orbitrap. Se eliminaron de los resultados todos los contaminantes de laboratorio y de manipulación.

Los análisis se realizaron en el Laboratorio de ADN Antiguo del Departamento de Patrimonio Cultural (Universidad de Bolonia), siguiendo estrictos estándares de flujo de trabajo paleogenómico105,106. Se aisló un segundo molar inferior izquierdo para la extracción de ADN antiguo (SLB2). El diente se limpió suavemente con HCl al 4%, se enjuagó con EtOH al 80% y luego se esterilizó bajo luz ultravioleta durante 20 minutos. Luego se rasparon 1 a 2 mm de la superficie externa de la raíz con una cuchilla giratoria para eliminar la capa superficial y se recogieron 60 mg de cemento y polvo de dentina perforando la raíz a baja velocidad con una broca dental. Para el análisis metagenómico, se tomó una muestra de un fragmento de 15 mg de cálculo dental (SLBT) del segundo incisivo inferior izquierdo y después de 20' de irradiación UV, se pulverizó sobre mortero esterilizado para la extracción de ADN. El aislamiento del ADN se realizó como en Dabney et al. (2013) con ligeras modificaciones de laboratorio como en Cilli et al. (2020)107 y las concentraciones moleculares se midieron en un fluorómetro QuBit. Los controles en blanco se procesaron junto con las muestras durante cada fase del análisis. Luego se construyeron bibliotecas monocatenarias para ambos extractos108, se combinaron en cantidades equimolares con otras muestras y se analizaron en busca de ADN endógeno en el carril HiSeqX Ten 2 × 150 pb. Una vez confirmada la presencia de ADN antiguo auténtico, la muestra de SLB se secuenció por segunda vez en el carril HiSeqX Ten 2 × 150 pb, generando > 500 millones de lecturas.

Los datos sin procesar se procesaron con Paleomix109: los archivos fastq se filtraron con AdapterRemoval110 que eliminó los adaptadores y lee menos de 30 pb. Luego, las lecturas se alinearon por separado con el genoma de referencia humano (GRCh37) y con una versión alargada del rCRS utilizando el algoritmo Circular Mapper v1.93.5 (https://github.com/apeltzer/CircularMapper) y bwa v0.7.17 aln111, con un mínimo de calidad del mapeo ≥ 20, semillas deshabilitadas y parámetro - n establecido en 0.01. Los duplicados de PCR se eliminaron automáticamente y la autenticidad de las lecturas se confirmó evaluando los patrones de desaminación en ambos extremos de las lecturas con mapDamage v2.2.1112. La contaminación humana moderna se estimó a nivel mitocondrial y de cromosoma X mediante Schmutzi113 y ANGSD v0.939114 respectivamente. Usamos Schmutzi para generar la secuencia consenso del ADN mitocondrial y al haplogrupo se le asignó HaploGrep2115 y Haplofind116. La opción—rescale de mapDamage se utilizó para reducir los valores de calidad de las posiciones probablemente dañadas de las lecturas debido a daños antiguos en el ADN. Luego, se descargó una lista de SNP informativos para el cromosoma Y de la Sociedad Internacional de Geneaología Genética (https://isogg.org/tree/) y el software yhaplo (https://github.com/23andMe/yhaplo) se utilizó para identificar el haplogrupo del cromosoma Y a partir de lecturas con puntuaciones de calidad de mapeo ≥ 30 y bases con puntuaciones de calidad ≥ 30. El sexo biológico del individuo se estimó calculando la proporción de lecturas alineadas con el cromosoma X como una porción del total de secuencias. mapeo de los autosomas utilizando el script R proporcionado en Mittnik et al. 2016117. Los resultados también se compararon con el enfoque de asignación de sexo proporcionado por Skoglund et al. 2013118, que calcula la proporción de lecturas asignadas al cromosoma Y como una parte de las alineaciones con los cromosomas sexuales. Se reconstruyó un árbol filogenético de máxima probabilidad con el software MEGA X119 utilizando un conjunto de datos de 130 euroasiáticos del Calcolítico al Neolítico Medio Tardío del haplogrupo K (Tabla complementaria S5), estableciendo el modelo de sustitución HKY + I + G, evaluado por JModelTest2120 y ejecutando 1000 bootstrap. repeticiones. La red de unión mediana (Figura complementaria S5) se realizó con el software Network v.10 (www.fluxus-engineering.com) utilizando parámetros predeterminados en un conjunto de 53 K1a (n = 19), K1a + 150 (n = 3) , K1a + 195 (n = 30) y K1f. (n = 1) individuos (Tabla complementaria S6). Los estiramientos Poly-C, los indeles AC en las posiciones 303–315, 515–524, 16,180–16,193 y la posición hipervariable 16,519 se excluyeron de la reconstrucción filogenética.

Los genotipos pseudohaploides se llamaron a partir de lecturas con calidad de mapeo ≥ 30 utilizando PileupCaller (https://github.com/stschiff/sequenceTools) que selecciona aleatoriamente una base de alta calidad (puntuación de calidad de base phred ≥ 30) según el panel de referencia de 1240 K. Se aplicó una base mínima y una calidad de mapeo de 30 filtros para el comando mpileup de samtools, y se generaron datos pseudohaploides llamando aleatoriamente a un alelo de cada sitio cubierto usando el script pileupCaller. Para la contextualización de SLB en la variabilidad del Mediterráneo antiguo, se seleccionó un conjunto de datos de 905 individuos antiguos del 1240 K—Human Origins SNP Array (https://reich.hms.harvard.edu/allen-ancient-dna-resource-aadr -genotipos-descargables-datos-de-adn-actuales-y-antiguos). Para cada una de las poblaciones mediterráneas observadas en el conjunto de datos original, solo se seleccionaron individuos de un período entre el Mesolítico y la Edad del Bronce, excluyendo a todos aquellos individuos que fueron referidos como duplicados, relacionados, contaminados y con poca cobertura.

Del conjunto de datos de HumanOrigins se extrajo un panel representativo de 1257 individuos modernos que se utilizará como base de referencia para la proyección PCA. Estos contienen un número menor de marcadores (~ 600 K SNP) pero tienen la ventaja de tener una buena cobertura de todas las poblaciones y de estar ya fusionados con las antiguas, lo que simplifica el procedimiento y evita mayores reducciones en el número de variantes al fusionarse. Por lo tanto, obtuvimos un panel de comparación de 2162 IND y 431,156 SNP (Tabla complementaria S7) de poblaciones euromediterráneas antiguas y modernas. Los datos del SLB antiguo se fusionaron con el conjunto de datos personalizado, quedando un total de 92.322 SNP después de una mayor poda (utilizando un filtro 200 25 0,4). Finalmente, hicimos la proyección PCA de los individuos antiguos con SLB en los HO euromediterráneos modernos, y las parcelas resultantes se dividieron en cuatro pantallas temporales, a saber, Mesolítico, Neolítico, Calcolítico y Edad del Bronce (Figura complementaria S6).

En este estudio se incluyó el genotipado de 20 habitantes modernos del cercano municipio de San Lorenzo Bellizzi. Todas estas muestras fueron seleccionadas según los criterios de abuelos y apellido del fundador, para garantizar al menos tres generaciones de ascendencia en el área, y excluyendo a individuos relacionados. Todos los procedimientos relativos a las muestras modernas fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Bolonia el 04/08/2013. Todos los donantes proporcionaron un consentimiento informado por escrito para el tratamiento de datos y los objetivos del proyecto. El estudio fue diseñado y realizado de acuerdo con los principios éticos para la investigación con seres humanos establecidos en la Declaración de Helsinki de la AMM. Las muestras de saliva se recolectaron con el kit de autocolección Oragene-DNA OG500 (DNA Genotek Inc., Ottawa, Ontario, Canadá). El ADN genómico se extrajo siguiendo las recomendaciones del fabricante y se cuantificó con el kit de ensayo dsDNA BR y el fluorómetro Qubit (Life Technologies, Carlsbad, CA).

Luego se genotiparon muestras de ADN para los 713.014 SNP incluidos en HumanOmniExpress BeadChip (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.), en el Centro de Investigación y Tecnologías Biomédicas del Instituto Auxológico Italiano (Milán, Italia). Las 20 muestras se fusionaron con 737 individuos ya publicados, representativos de la variabilidad genética a lo largo de la península italiana, así como de Cerdeña121. La fusión se realizó con PLINK v.1.9122 teniendo en cuenta solo los SNP autosómicos que se compartieron en los dos conjuntos de datos, obteniendo un nuevo conjunto de 757 individuos y 254.709 variantes. Luego se llevó a cabo un control de calidad estándar con funciones implementadas en el mismo paquete PLINK para garantizar una alta calidad del conjunto de datos final resultante de individuos modernos. Específicamente, se verificó la falta de datos en todos los SNP y entre individuos con un umbral de 0,05, lo que dejó 254.614 SNP y 757 individuos; También se inspeccionó el respeto del equilibrio de Hardy-Weinberg, imponiendo una corrección de Bonferroni para pruebas múltiples al umbral estándar de 0,01, de modo que el nuevo umbral sea igual a 3,9275e−8. También se probaron variantes en el desequilibrio de ligamiento utilizando un enfoque de ventana deslizante con una ventana de tamaño 500 SNP, un paso de 50 SNP y un umbral de LD de 0,1 y, si se detectaba, se eliminaba aleatoriamente una variante del conjunto de datos. El control de calidad completo arrojó 49.586 SNP y 757 individuos. Finalmente, el conjunto de datos (757 + individuo SLB) se proyectó sobre el fondo genético moderno utilizando el software SmartPCA del paquete EIGENSOFT usando la opción lsqproject: YES.

Aplicamos HOPS31 para caracterizar el perfil metagenómico de las lecturas de escopeta. Las secuencias se alinearon primero con la base de datos utilizando una versión modificada de MALT123,124. En particular, la base de datos se creó mediante malt-build utilizando los genomas bacterianos “representantes” y de “referencia” (n = 11,270) y arqueales (n = 408) descargados de NCBI RefSeq el 16 de noviembre de 2020. Las lecturas asignadas a genomas bacterianos se extrajeron con la herramienta MaltExtract y se realinearon con sus respectivos genomas de referencia para evaluar las distancias de edición, las distribuciones de cobertura y los patrones de daño del ADN post-mortem31,125,126. Para este objetivo, utilizamos MapDamage112 para estimar las tasas de desaminación. Las distribuciones de la puntuación de degradación post mortem (PMDS) se calcularon utilizando PMDtools127. La amplitud y profundidad de la cobertura se estimaron utilizando instrumentos de cama128. Se utilizaron distancias de edición para todas las secuencias en comparación con sus referencias para calcular la puntuación de proporción de diferencia negativa (−Δ %) como lo describieron previamente Hübler y colegas (2019)31. A − Δ % > 0,9 se consideró relevante para una distribución decreciente relacionada con el perfil de ADN antiguo. Los taxones con más de 300 lecturas asignadas, más de 50 lecturas con PMDS > 1, − Δ % > 0,9 y que muestran patrones de transición CT en 5 ′ se consideraron de origen antiguo. La base de datos de referencia MALT se creó utilizando el comando malt-build y seleccionando los genomas bacterianos “representantes” y de “referencia” (n = 11,270) y arqueales (n = 408) de NCBI RefSeq (16 de noviembre de 2020). Se utilizó el mismo proceso en un conjunto de datos de 114 cálculos dentales derivados de estudios previos35,36, incluidos neandertales y humanos de diferentes épocas (período preagrícola, neolítico, preantibiótico y humanos modernos). Los datos de secuenciación se descargaron del repositorio de ENA (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home) con los ID de acceso del proyecto PRJEB34569 y PRJEB44313. Se descargaron lecturas sin procesar de los respectivos repositorios y se aplicó la canalización HOPS utilizando los mismos parámetros enumerados anteriormente. Los recuentos bacterianos resultantes normalizados para la profundidad de secuenciación se utilizaron para realizar un análisis de PCoA con la distancia de Bray-Curtis.

También se realizaron pruebas de detección de patógenos bacterianos potenciales, mediante la búsqueda de rastros específicos de su ADN dentro de los resultados del mismo proceso de HOP descrito anteriormente. En particular, buscamos rastros genómicos de patógenos declarados por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como las enfermedades infecciosas más relevantes para la salud humana129. Seleccionamos aquellas bacterias cuyos genomas estaban incluidos dentro de la base de datos HOPS: Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Borrelia, Brucella, Campylobacter jejuni, Clostridioides difficile, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus, Klebsiella pneumoniae, Legionella, Listeria, Mycobacterium haemophylum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Serratia marcescens, Shigella, Staphylococcus aureus, Streptococcus gordonii, Streptocossus mutans, Stre ptococcus pneumoniae, treponema pallidum, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica y Yersinia pestis. Los taxones con más de 10 CPM (lecturas que coinciden con la referencia específica por millón de lecturas secuenciadas) se sometieron al mismo análisis informado anteriormente (puntuación de proporción negativa, distribuciones de cobertura y patrones de daño del ADN post-mortem31,125,126), para validar su antigua origen.

Todos los datos producidos o analizados durante el presente estudio están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Los datos genéticos sin procesar de dientes y cálculos se depositan en el Archivo Europeo de Nucleótidos con el número de acceso al proyecto PRJEB58818. El genoma mitocondrial reconstruido de SLB está disponible en GenBank con el número de acceso OQ301533. Los conjuntos de datos de proteínas antiguas detectadas en cálculos dentales se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio asociado de la Base de datos de identificaciones de proteómica (PRIDE) con el identificador PXD039654 [Nombre de usuario: [email protected]; Contraseña: iFHQ4lrk]. Los restos óseos se encuentran almacenados en el Centro de Investigaciones Espeleoarqueológicas de San Lorenzo Bellizzi (CS).

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Los autores desean agradecer al Dr. Leonardo Larocca, médico de San Lorenzo Bellizzi, quien supervisó la investigación con los habitantes modernos, y al Dr. Andrea De Giovanni, que ayudó en los procesos de muestreo. Un reconocimiento especial a la población de San Lorenzo Bellizzi, al alcalde y a la administración del municipio, cuyo esfuerzo y vínculo inseparable con sus raíces hicieron posible este estudio. Este trabajo se sustenta en la subvención MIUR-PRIN 20177PJ9XF a DL.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Elisabetta Cilli y Donata Luiselli.

Departamento de Patrimonio Cultural, Universidad de Bolonia, Via Degli Ariani 1, 48121, Rávena, Italia

Francesco Fontani, Mirko Traversari, Adriana Latorre, Rocco Iacovera, Paolo Abondio, Elisabetta Cilli y Donata Luiselli

Departamento de Ciencias de la Vida y Biología de Sistemas, Universidad de Turín, Via Accademia Albertina 13, 10123, Torino, Italia

Rosa Boano, Alessandra Cinti, Beatrice Demarchi, Sarah Sandron y Meaghan Mackie

Departamento de Farmacia y Biotecnología, Universidad de Bolonia, Via Belmeloro 6, 40126, Bolonia, Italia

Simone Rampelli y Marco Candela

Departamento de Ciencias Biológicas, Geológicas y Ambientales, Universidad de Bolonia, Via Selmi 3, 40126, Bolonia, Italia

Paolo Abondio y Stefania Sarno

Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk, Universidad de Copenhague, Blegdamsvej 3B, 2200, Copenhague, Dinamarca

Meaghan Mackie

Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, The Globe Institute, Universidad de Copenhague, Øster Farimagsgade 5, 1353, Copenhague, Dinamarca

Meaghan Mackie y Mateo Collins

Escuela de Arqueología, University College Dublin, Belfield, Dublín 4, Irlanda

Meaghan Mackie y Anita Radini

Instituto McDonald de Investigaciones Arqueológicas, Universidad de Cambridge, Downing Street, Cambridge, CB2 3ER, Reino Unido

Mateo Collins

SIOF – Sociedad Italiana de Odontología Forense, Strada Degli Schiocchi 12, 41124, Módena, Italia

Chantal Milani

Unidad de Radiología, Hospital Morgagni-Pierantoni, AUSL Romagna, Via Carlo Forlanini 34, 47121, Forlì, Italia

Enrico Petrella y Emanuela Giampalma

Departamento de Humanidades, Educación y Ciencias Sociales, Universidad de Molise, Via Francesco De Sanctis, 86100, Campobasso, Italia

Antonella Minelli

Grupo de Investigación Espeleo-Arqueológica, Universidad de Bari, Piazza Umberto I 1, 70121, Bari, Italia

feliz laroca

Centro de Investigaciones Espeleo-Arqueológicas “Enzo dei Medici”, Via Lucania 3, 87070, Roseto Capo Spulico (CS), Italia

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DL, EC y FL concibieron la idea original; FF, EC, AL, Sa.S., MM, AR, EP, EG y MT realizaron los experimentos; FF, RB, AC, BD, SR, MT, PA, RI, St.S., MM, AR y CM analizaron los datos; FF escribió el manuscrito original, con aportaciones de todos los autores; AM, M.Ca. y M.Co. ayudó a supervisar el proyecto; Todos los autores revisaron y aprobaron la versión enviada del manuscrito.

Correspondencia a Francesco Fontani o Donata Luiselli.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Fontani, F., Boano, R., Cinti, A. et al. Perfil bioarqueológico y paleogenómico del inusual entierro neolítico de Grotta di Pietra Sant'Angelo (Calabria, Italia). Representante científico 13, 11978 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39250-y

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Recibido: 27 de enero de 2023

Aceptado: 21 de julio de 2023

Publicado: 24 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39250-y

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