El injerto óseo humano criopreservado viable exhibe propiedades osteogénicas superiores en el aumento lateral mandibular

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 1422 (2023) Citar este artículo

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La falta de volumen óseo para colocar implantes dentales es frecuentemente un problema en la reconstrucción de pacientes edéntulos. Aunque los autoinjertos son el estándar de oro para la regeneración de la mandíbula, la morbilidad asociada con el lugar de extracción estimula la demanda de otros sustitutos. El objetivo de este estudio es caracterizar la incorporación y la capacidad osteogénica de un injerto óseo humano criopreservado viable (VC-HBG) en el aumento mandibular en ratas. Se procesaron, crioprotegieron y congelaron a -80 °C fragmentos de hueso de donantes cadavéricos de vértebras humanas frescas, manteniendo su viabilidad celular. Se utilizó un modelo de aumento de mandíbula en 20 ratas desnudas atímicas asignadas en 2 grupos para recibir VC-HBG o un injerto acelular como control (A-HBG). La evaluación de la incorporación de los injertos se realizó a las 4 y 8 semanas mediante micro-TC, histomorfometría e inmunohistoquímica. La ganancia de volumen óseo fue significativamente mayor para el grupo VC-HBG en ambos momentos. A las 4 semanas, el grupo A-HBG presentó una densidad mineral significativamente mayor, pero a las 8 semanas, el grupo VC-HBG mostró valores significativamente más altos que el A-HBG. No hubo diferencias estadísticas entre los grupos VC-HBG y A-HBG a las 4 semanas para las partículas de injerto restantes, mientras que a las 8 semanas, el grupo VC-HBG mostró significativamente menos restos de injerto. La expresión de colágeno I, osteopontina y fosfatasa ácida resistente a tartrato fue significativamente mayor en el grupo VC-HBG en ambos momentos, mientras que la expresión de osteocalcina fue significativamente mayor en el grupo VC-HBG a las 8 semanas en comparación con el grupo A-HBG. Esta investigación experimental demostró que el VC-HBG muestra propiedades osteogénicas positivas, mayor formación ósea, mayor tasa de remodelación ósea y una mejor incorporación general en las mandíbulas de las ratas en comparación con el A-HBG.

La atrofia ósea es una secuela fisiológica después de la pérdida de dientes y comúnmente resulta en una estructura insuficiente para estabilizar los implantes dentales, lo que lleva a mayores tasas de fracaso, resultados estéticos insatisfactorios o diseño protésico deficiente. Para reconstruir adecuadamente el volumen óseo y la anatomía de la cresta alveolar antes de la colocación del implante, el médico dispone actualmente de varias técnicas quirúrgicas y biomateriales1,2. Los injertos autólogos han sido ampliamente investigados y la literatura científica reporta resultados favorables con buenas tasas de éxito, logrando una ganancia de volumen efectiva y estable sin preocupación por la respuesta inmune o la transmisión de enfermedades. Por lo tanto, los autoinjertos se consideran el material de referencia para la reconstrucción ósea en el campo odontológico3,4. Sin embargo, la morbilidad relacionada con el sitio de extracción quirúrgica del donante y el riesgo de complicaciones como parestesia, hemorragia, daño a estructuras vitales y edema excesivo han alentado a los investigadores a buscar el desarrollo de biomateriales de injerto que sean capaces de reemplazar con éxito el hueso autógeno durante la cresta alveolar. procedimientos de aumento5,6,7.

Las propiedades osteogénicas de los autoinjertos se deben a su contenido único en células viables y proteínas inductivas. La tríada de ingeniería de tejidos se logra con células, señalización química y un andamio adecuado que permitirá que las células migren, se adhieran y produzcan tejido nuevo1. Las células estromales derivadas de la médula ósea (MSC) tienen el potencial de diferenciarse en distintos linajes celulares, incluidos los osteoblastos formadores de hueso. Los intentos de mejorar los injertos óseos utilizando MSC han demostrado una formación de volumen óseo mayor y más rápida en comparación con los injertos de biomateriales comúnmente utilizados8,9. En un estudio reciente de nuestro grupo de investigación, se observó que las micropartículas de hueso cadavérico humano sembradas con MSC aisladas de médula ósea mostraron propiedades osteogénicas positivas, lo que resultó en una formación ósea significativamente más rápida junto con una mayor tasa de recambio óseo y una mejor incorporación general, en comparación con su contraparte acelular10. Más recientemente, un nuevo método de procesamiento de huesos humanos ha permitido la producción de un material de injerto óseo que preserva su contenido de células viables durante la criopreservación.

El objetivo de este estudio es caracterizar la incorporación y determinar la capacidad osteogénica de este novedoso injerto óseo humano criopreservado viable (VC-HBG) durante el aumento lateral mandibular en ratas.

El procedimiento quirúrgico utilizado se describe con mayor detalle en la sección de material y “Métodos”. Todos los animales toleraron bien las cirugías y no se observaron eventos adversos postoperatoriamente. Tampoco en todos los animales hubo signos de infecciones que pudieran comprometer los análisis histológicos, inmunohistoquímicos y tomográficos.

Las variables cuantitativas analizadas mediante micro-CT se presentan mediante media, mediana, desviación estándar, mínimo, máximo y rango intercuartil por tipo de injerto en la Tabla 1.

A las 4 semanas, el BV promedio en el grupo VC-HBG fue significativamente mayor (34,97 ± 4,97 mm3) que la media del grupo A-HBG (12,43 ± 2,53 mm3, p < 0,001). A las 8 semanas, también hubo una diferencia estadísticamente significativa (p = 0,002) entre el BV medio en el grupo VC-HBG (48,59 ± 3,99 mm3) y A-HBG (35,18 ± 4,98 mm3), ver Fig. 1A. VC-HBG presentó un volumen significativamente mayor que los injertos de A-HBG a las 4 y 8 semanas (p <0,001).

Asociación entre ganancia de volumen óseo (mm3) (A), densidad mineral ósea (DMO) (B), porcentaje de volumen óseo (C), relación superficie ósea/volumen total (D) y tipo de injerto en cada momento. Injerto óseo humano acelular A-HBG, injerto óseo humano criopreservado viable VC-HBG.

A las 4 semanas, el grupo A-HBG presentó una densidad mineral significativamente mayor (0,71 ± 0,04 mg/cm3) que el grupo VC-HBG (media = 0,62 ± 0,06 mg/cm3, p = 0,032). Por el contrario, a las 8 semanas, el grupo que recibió VC-HBG (media: 0,63 ± 0,03 mg/cm3) tuvo valores significativamente más altos (p = 0,025) que el grupo A-HBG (media: 0,58 ± 0,04 mg/cm3), ver la figura 1B.

A las 4 semanas, el PBV medio del grupo A-HBG fue mayor que el del grupo VC-HBG (63,22 ± 8,55% y 46,25 ± 4,36%, respectivamente), p = 0,004. Sin embargo, a las 8 semanas, los grupos A-HBG y VC-HBG no mostraron diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05), ver Fig. 1C. Los injertos de VC-HBG a las 8 semanas mostraron un PBV significativamente menor que el A-HBG a las 4 semanas (p = 0,004).

BS/VR fueron significativamente mayores para el grupo VC-HBG (23,49 ± 1,61) en comparación con el grupo A-HBG (17,41 ± 3,19) en el momento de las 4 semanas, como se muestra en la Fig. 1D (p = 0,005).

Las variables histomorfométricas cuantitativas descriptivas se presentan mediante media, mediana, desviación estándar, mínimo, máximo y rango intercuartil por tipo de injerto en la Tabla 2.

El porcentaje de hueso recién formado dentro del área injertada fue significativamente mayor en el grupo VC-HBG en ambos intervalos de tiempo (p = 0,001), ver Fig. 2A y C.

Asociación entre formación de hueso nuevo (A), restos de injerto (B) y tipo de injerto en cada momento. En (C) se muestran imágenes representativas de H&E con aumentos de 10× y 40×. Injerto óseo humano acelular A-HBG, injerto óseo humano criopreservado viable VC-HBG.

No hubo diferencias estadísticas entre el grupo VC-HBG y A-HBG a las 4 semanas en cuanto al porcentaje de partículas restantes del injerto (p = 0,047). A las 8 semanas, el grupo VC-HBG mostró un porcentaje significativamente menor de restos de injerto que el grupo A-HBG (8,07 ± 4,55% vs. 20,93 ± 11,37%, respectivamente; p = 0,047), ver Fig. 2B y C.

Las variables inmunohistoquímicas cuantitativas se presentan mediante media descriptiva, mediana, desviación estándar, mínimo, máximo y rango intercuartil por tipo de injerto en la Tabla 3. La expresión de osteocalcina (OCN) fue significativamente mayor (p < 0,001) en el grupo VC-HBG a las 8- semanas (230,49 ± 56,34 píxeles, px) en comparación con el grupo A-HBG (151,59 ± 29,23 px), ver Fig. 3A. En general, los injertos a las 8 semanas (216,95 ± 54,78 px) mostraron una expresión de OCN significativamente mayor (p = 0,006) que los de 4 semanas (165,14 ± 54,72 px), ver Fig. 3A. En ambos momentos, la expresión de colágeno I (COL 1) fue significativamente mayor en el grupo VC-HBG (p = 0,021 a las 4 semanas y p = 0,050 a las 8 semanas), ver Fig. 3B. La expresión de osteopontina (OPN) fue significativamente mayor (p <0,001) en el grupo VC-HBG en ambos intervalos de tiempo (p <0,001 para los puntos temporales de 4 y 8 semanas), ver Fig. 3C. La expresión de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) fue significativamente mayor en el grupo VC-HBG en ambos momentos. A las 4 semanas, la expresión de TRAP en el grupo A-HBG fue de 1,10 ± 0,25 células/campo de visión (FOV) y de 1,92 ± 0,47 células/FOV en el grupo VC-HBG (p = 0,009). A las 8 semanas, la expresión de TRAP para el grupo VC-HBG (2,06 ± 0,57 células/FOV) fue significativamente mayor (p = 0,016) que la del grupo A-HBG (1,02 ± 0,51 células/FOV), ver Fig. 3D.

Asociación entre OCN (A), COL1 (B), OPN (C), TRAP (D) y tipo de injerto en cada momento. Injerto óseo humano acelular A-HBG, injerto óseo humano criopreservado viable VC-HBG, osteocalcina OCN, colágeno COL1 tipo 1, osteopontina OPN, fosfatasa ácida resistente a tartrato TRAP.

A menudo es necesario el aumento óseo de las mandíbulas antes de los procedimientos de colocación de implantes dentales. A pesar del desarrollo de varios biomateriales y diferentes técnicas, el proceso de incorporación lleva tiempo y frecuentemente resulta en la pérdida del volumen óseo inicial injertado11,12. En nuestro estudio, se observó que los animales a los que se les había injertado chips de hueso humano criopreservados viables (VC-HBG) mostraron un aumento significativamente mayor en el volumen óseo que los animales que recibieron A-HBG, en intervalos de tiempo de 4 y 8 semanas. .

La densidad mineral ósea (DMO) ha cambiado significativamente en el grupo de control mientras se mantiene la estabilidad en el grupo de prueba. Aunque los injertos VC-HBG mostraron puntuaciones más bajas en comparación con los A-HBG en el intervalo de 4 semanas, la DMO del grupo A-HBG disminuyó significativamente a las 8 semanas y presentó menor densidad que el grupo VC-HBG. A medida que los injertos óseos se incorporan al sitio receptor mediante reemplazo progresivo, se espera que la reabsorción de estos injertos ocurra seguida por el depósito de osteoide y su posterior mineralización13,14. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el contenido de células viables del grupo VC-HBG puede haber contribuido a un recambio óseo más rápido, disminuyendo la cantidad de material mineral al aumentar la actividad osteoclástica y, en consecuencia, disminuyendo y estabilizando la DMO. Para el grupo A-HBG, la mayor DMO a las 4 semanas podría explicarse por una reabsorción más lenta del injerto y, por tanto, un mayor contenido mineral. Aunque no se ha probado directamente, los datos de inmunohistoquímica sobre el recuento de células TRAP (que muestran más actividad de osteoclastos en el grupo VC-HBG) y la cantidad de injerto remanente en la histomorfometría (queda más injerto en el grupo control) corroboran esta hipótesis. La mayoría de los estudios que compararon diferentes tipos de estructuras óseas sembradas con células de diferentes orígenes encontraron que la relación superficie/volumen óseo (BS/VR) era mayor en los grupos de células que en los grupos de control15,16,17. Por otro lado, los datos del presente estudio mostraron que a las 4 semanas el grupo A-HBG exhibió BS/VR significativamente mayor que el grupo VC-HBG y no hubo diferencias estadísticas entre los grupos a las 8 semanas. Un proceso similar al que se encontró para la DMO podría haber resultado en una disminución de la superficie ósea, reduciendo la BS/VR a las 4 semanas y logrando proporciones comparables para ambos grupos a las 8 semanas. Desde esta perspectiva, la principal ventaja del contenido celular viable sería acelerar el proceso de sustitución del injerto y maduración ósea, aunque con el tiempo no habría diferencia entre ambos grupos. Esta característica podría resultar conveniente cuando se traslade a entornos clínicos, reduciendo el tiempo de curación esperado antes de colocar implantes dentales. Es importante enfatizar que la evaluación por micro-CT debe analizarse en conjunto con la histología, la histomorfometría y la inmunohistoquímica para poder interpretar los resultados. Por lo tanto, las puntuaciones más altas de DMO y BS/VR observadas en el grupo A-HBG pueden correlacionarse con las secciones de histología donde se observó una gran cantidad de restos de injerto a las 4 semanas18.

Histomorfométricamente, el grupo VC-HBG presentó valores más altos de hueso neoformado en ambos intervalos de tiempo, lo que concuerda con nuestros resultados de micro-CT. En nuestro estudio anterior10, el porcentaje de hueso recién formado en el grupo celularizado fue mayor que el del grupo acelular a las 4 semanas, sin embargo, a las 8 semanas no mostró diferencia estadística. En el presente estudio, se observó una mayor formación de hueso nuevo con VC-HBG a las 8 semanas en comparación con el grupo A-HBG. Chamieh et al.15 también informaron que el porcentaje de hueso recién formado fue significativamente mayor en los días 14, 21, 28 y 35 después del injerto cuando se utilizaron armazones sembrados con MSC de pulpa dental de rata en comparación con armazones acelulares y con defectos no injertados. Wofford et al.19 también demuestran una mayor formación ósea en defectos maxilares de ratones tratados con Gelfoam® y MSC humanas de tejido adiposo, en comparación con un grupo tratado con Gelfoam® solo en un período de 4 semanas. A las 12 semanas, no encontraron diferencias estadísticas, lo que sugiere una curación ósea aumentada y temprana en presencia de MSC de tejido adiposo humano. A diferencia de lo que encontramos en nuestro estudio anterior10, no hubo diferencia estadística en el porcentaje de partículas restantes del injerto entre los grupos a las 4 semanas. En este intervalo de tiempo, ambos grupos tuvieron una mayor cantidad de restos de injerto que a las 8 semanas, lo cual era esperable, ya que con el tiempo las partículas del injerto deberían ser reemplazadas por hueso nuevo. A las 8 semanas, el grupo VC-HBG tenía un porcentaje significativamente menor de restos de injerto que el grupo A-HBG. Este resultado contribuyó a la comprensión de la comparación de los parámetros de DMO, SB/VS y porcentaje de restos óseos: el grupo de prueba a las 8 semanas, a pesar de tener menos partículas remanentes, presentó mayor volumen óseo y mayor DMO, demostrando que había mayor formación ósea en este grupo en comparación con el control a las 8 semanas.

El colágeno tipo I se expresa principalmente en osteoblastos y representa un componente orgánico importante de la matriz ósea alveolar20, teniendo un papel crítico en la estructura y función del tejido óseo21. La expresión de colágeno tipo I puede considerarse como un marcador de formación ósea temprana22. En nuestro estudio, la expresión de COL I fue mayor en el grupo VC-HBG que en el grupo A-HBG, en ambos momentos. La mayor diferencia se observó a las 4 semanas, lo que demuestra que la presencia de células en los injertos contribuyó a un rápido aumento en el depósito de matriz extracelular ósea. Este hallazgo es consistente con los hallazgos de Chamieh et al.15, quienes utilizaron la técnica de hibridación in situ, usando una sonda específica para Col1a1, y encontraron una fuerte expresión de colágeno en andamios sembrados con MSC de pulpa dental de rata, mientras que solo señales débiles asociadas con Col1a1 se observaron en andamios acelulares. La osteocalcina (OCN) se considera una de las proteínas no colágenas más abundantes, ya que se deposita en cantidades importantes en la matriz ósea. Es sintetizado y secretado predominantemente por osteoblastos maduros, condrocitos hipertrofiados y odontoblastos, tiene afinidad por el calcio y juega un papel importante en la neoformación y mineralización ósea23,24. El papel exacto de esta proteína en la remodelación ósea no se ha dilucidado completamente, aunque su estructura indica interacción con cristales de calcio y hidroxiapatita. Sin embargo, parece ser una vía importante para activar la formación ósea, debido a su efecto sobre los osteoblastos. La aparición y aumento de la producción de osteocalcina coincide con el inicio del proceso de mineralización25,26. En nuestro estudio, no se encontraron diferencias significativas en la expresión de OCN a las 4 semanas. A las 8 semanas, el grupo VC-HBG mostró una mayor expresión de OCN. Este resultado difirió de lo encontrado en nuestro estudio anterior10, que mostró un mayor número de células OCN positivas en el grupo VC-HBG en el intervalo de 4 semanas y ninguna diferencia estadística a las 8 semanas. Como la expresión de OCN es un marcador de formación ósea tardía involucrada durante el proceso de mineralización22,23,24,25, esto podría ser una explicación para la mayor expresión observada solo a las 8 semanas. Una observación similar fue hecha por Tera et al.27 en un estudio con ratas ovariectomizadas, que recibieron injerto óseo autógeno. La tinción con OCN no se observó durante la formación inicial de cristales, pero se pudo encontrar en las últimas etapas de la formación ósea, con positividad de osteoblastos y matriz ósea recién formada en los días 45 y 60, lo que revela características del hueso maduro. De Ponte et al.28 también observaron células inmunopositivas para OCN sólo después de 6 meses de injerto de elevación del seno maxilar con hueso acelular fresco congelado en humanos. En el hueso, la osteopontina (OPN) es sintetizada y secretada por osteoblastos, osteocitos y osteoclastos29. Es una proteína de matriz multifuncional que interviene en la regulación de la mineralización fisiológica y patológica. La OPN sirve tanto para unir las células óseas a la matriz como para generar señales intracelulares esenciales para la motilidad normal de los osteoclastos en el hueso30. Es producido por células osteoblásticas en diferentes estadios y se ha sugerido que su expresión se produce en dos picos31. Por tanto, esta proteína es detectable en células madre de médula ósea con niveles intermedios de expresión en las primeras etapas de diferenciación durante la proliferación de células precursoras como los preosteoblastos y en niveles elevados en osteoblastos32. En el presente estudio, la expresión de OPN fue mayor en el grupo VC-HBG que en el grupo A-HBG, en ambos intervalos de tiempo. Wofford et al.19 demostraron una expresión notable de OPN en ratones en la semana 4 con muestras tratadas con Gelfoam® más MSC humanas derivadas de tejido adiposo que muestran una distribución morfológica más organizada de esta proteína en comparación con el patrón caótico en muestras de Gelfoam® sin células. Nuestro estudio mostró una mayor expresión de proteínas implicadas en la osteogénesis (OCN, OPN y COL I) en el grupo VC-HBG en comparación con el grupo A-HBG, lo que sugiere que existe un aumento en el proceso de mineralización y formación ósea en injertos óseos con células, corroborando con nuestro estudio anterior10.

La fosfatasa ácida resistente al tartrato es una enzima que se encuentra en los osteoclastos y los eritrocitos y se libera durante la resorción ósea, lo que promueve la degradación de la matriz orgánica. Se considera un marcador importante de la actividad osteoclástica33. En el presente trabajo, el grupo VC-HBG mostró una mayor expresión de TRAP en ambos momentos, a diferencia de nuestros hallazgos anteriores con injerto sembrado de células10, en los que hubo una mayor positividad para TRAP solo a las 4 semanas. La detección de osteoclastos TRAP positivos, que también se encontraron en las superficies de los huesos recién formados, indica un proceso temprano de remodelación en curso, mayor en el grupo con VC-HBG, que en este estudio se mantuvo hasta el intervalo de tiempo de 8 semanas.

Este es el primer estudio que demuestra los beneficios superiores de los injertos óseos humanos criopreservados viables (VC-HBG) para el aumento mandibular. Sin embargo, el modelo animal utilizado impone limitaciones metodológicas. Las ratas atímicas toleraron bien la implantación de células humanas y fragmentos óseos, sin presentar reacciones adversas ni inmunológicas. Sin embargo, el material injertado debe considerarse como un injerto xenogénico en este estudio, de manera diferente a lo que esperaríamos en el contexto de un uso clínico en humanos. Además, no fue posible determinar con precisión la evolución cronológica de los procesos de incorporación y remodelación en un mismo individuo debido a la necesidad de utilizar diferentes animales para evaluar los parámetros en diferentes momentos temporales. Finalmente no pudimos comprobar la superioridad del VC-HBG para su finalidad final que es la colocación de implantes dentales. Por tanto, existe la necesidad de realizar futuras investigaciones sobre el comportamiento de los injertos cicatrizados en presencia de implantes. A pesar de estas limitaciones, los resultados de esta investigación experimental demostraron que el VC-HBG tiene propiedades osteogénicas positivas, una mayor formación ósea, una mayor tasa de remodelación ósea y una mejor incorporación general en las mandíbulas de las ratas en comparación con el A-HBG. Se necesitan estudios futuros en animales más grandes, con la posterior colocación de implantes dentales, y estudios clínicos en humanos para evaluar la viabilidad y los resultados a largo plazo resultantes del uso de VC-HBG en el campo dental.

Se recolectaron fragmentos de vértebras humanas frescas del Banco de Tejidos de la Universidad de Miami de donantes cadavéricos y se trituraron en una trituradora de huesos manual para producir astillas de huesos de tamaños visualmente uniformes. Luego, las astillas de hueso se lavaron exhaustivamente con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y se liofilizaron para eliminar cualquier contenido de células viables. En el momento de su uso, los VC-HBG se lavaron con DPBS después de descongelarlos. Los A-HBG se hidrataron con DPBS antes de su uso. La consistencia macromorfológica, textura y apariencia de ambos materiales después de la preparación fueron indistinguibles. El tamaño de partícula para ambos grupos estuvo entre 250 y 1000 µm.

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Miami y todos los métodos se realizaron de acuerdo con las regulaciones pertinentes, incluidas las pautas de ARRIVE. En este estudio se utilizaron veinte ratas desnudas atímicas (NTac: NIH-Foxn1rnu, hembra, 10 semanas de edad, con un peso de 150 a 200 g). El análisis de potencia y los cálculos del tamaño de la muestra se realizaron utilizando el software G*Power 3.0. El análisis de potencia de la muestra utilizando un diseño experimental ANOVA unidireccional que incluye 4 grupos independientes con α = 0,05, un efecto de 0,85 y un tamaño de muestra de 20 animales (para todos los grupos) da como resultado una potencia de > 0,80. Los animales fueron asignados aleatoriamente en 2 grupos diferentes con 10 individuos, con 2 intervalos de tiempo cada uno (n = 5 animales por "punto de tiempo"). Todas las cirugías fueron realizadas por el mismo cirujano bucal experimentado (Daniel Deluiz) como se describió anteriormente10. Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano y luego colocadas sobre una almohadilla térmica a 37 °C. Se aplicó Puralube® Vet Ointment en los ojos para evitar que se sequen. Se realizó antisepsia en la zona submandibular con polivinilpirrolidona yodada tópica. El abordaje quirúrgico submandibular se realizó a través de una incisión lineal que involucra las capas cutánea y subcutánea exponiendo el músculo masetero. Se realizó una incisión en el músculo a lo largo del borde submandibular teniendo cuidado de no dañar el nervio facial. Se levantó un colgajo que incluía el músculo y el periostio, exponiendo la cara lateral de la mandíbula de la rata, creando así una bolsa debajo del masetero. El lecho huésped se mantuvo intacto para evitar fracturas o hueso insuficiente para estabilizar el tornillo de titanio. Se fijó un microtornillo de titanio de 4,0 mm de largo y 1,5 mm de diámetro (KLS Martin, Tuttlingen, Alemania) en el lado lateral de la mandíbula para mantener el espacio y estabilizar el injerto mediante la técnica de la tienda de campaña34. Luego se colocó el material (VC-HBG o A-HBG) alrededor y encima del tornillo. Se eligió la cantidad de material (0,1 cc) para llenar completamente el vacío entre el hueso y el músculo elevado y luego se cubrió con una membrana amniótica reabsorbible para mantener la estabilidad del material en su lugar. Se realizaron cirugías experimentales previas en animales no incluidos en el estudio para definir la estrategia y estandarización de la aplicación del material. El cierre de la herida se realizó en los planos muscular y cutáneo con suturas Vicryl 5-0. La duración media del procedimiento y la anestesia fue de 15 min para cada animal. La terapia con antibióticos se llevó a cabo con una dosis única de gentamicina (5,0 mg/kg IM) y se administró buprenorfina (0,1 mg/kg SC) una vez antes de la cirugía y 3 días después para el control del dolor. Las ratas recibieron una dieta blanda posoperatoria durante 3 días y luego se les devolvió el régimen estándar de alimentos secos. El agua se proporcionó ad libitum.

Los animales fueron sacrificados a las 4 y 8 semanas mediante inhalación de CO2 y decapitados antes de escanearlos en el dispositivo micro-CT (SkyScan 1176, Bruker, Kontich, Bélgica). A cada cabeza/muestra se le asignó un número de referencia para cegar al examinador a los análisis. Los parámetros de imagen fueron: filtro de aluminio de 1 mm, exposición de 71 ms, 65 kV, 385 µA, tamaño de píxel de 18 µm y paso de rotación de 0,70°. Las imágenes se reconstruyeron utilizando el software NRecon (Bruker) con una corrección de endurecimiento del haz del 30%. Los análisis fueron realizados de forma ciega por el mismo investigador presentando un índice Kappa de reproducibilidad intraexaminador de 0,90. Todos los conjuntos de datos se alinearon con la misma orientación (el lado lateral de la mandíbula alineado horizontalmente y el tornillo de titanio alineado verticalmente) utilizando el software DataViewer (Bruker). En las imágenes reconstruidas utilizando el CTAnalyser se seleccionó una región de interés (ROI1) que comprende toda el área injertada (formación calcificada homogénea alrededor del tornillo de titanio más micropartículas diseminadas resultantes del exceso de material) y excluyendo la mandíbula de la rata (y el tornillo de titanio). software (Bruker). Para evitar el análisis del exceso de material que no participaba en el aumento óseo, se seleccionó una nueva región dentro del ROI1: ROI2. El ROI2 se definió de manera estandarizada para todas las muestras utilizando un umbral de Unidad Hounsfield (entre + 200 y + 2000 HU). Este umbral incluía el área visualmente injertada (formación calcificada homogénea alrededor del tornillo de titanio) y excluía el exceso de partículas (y el tornillo) de las mediciones. Los parámetros evaluados en el ROI2 fueron: volumen óseo ganado (BV), densidad mineral ósea (BMD), porcentaje de volumen óseo (PBV), relación superficie ósea/volumen (BS/VR) y densidad de la superficie ósea (BSD).

Inmediatamente después del análisis de la micro-CT, las mandíbulas se extirparon quirúrgicamente junto con el tejido circundante y se fijaron con formalina tamponada neutra al 10% durante 1 semana. Los tornillos de titanio se retiraron teniendo cuidado de no dañar las zonas injertadas. Las muestras se descalcificaron con solución descalcificante Cal-Ex (Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.) durante 3 días, se enjuagaron en agua destilada, se deshidrataron en alcohol, se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina. Luego se cortaron muestras de bloques de parafina con un espesor de 3 µm y luego se tiñeron con hematoxilina y eosina para evaluación histológica e histomorfométrica. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio óptico Nikon Eclipse 90i.

La evaluación histomorfométrica fue realizada por un único investigador ciego y capacitado utilizando 4 imágenes de cada muestra (suficientes para cubrir toda el área injertada) con un aumento de 10X utilizando el software ImageJ (NIH). El investigador había sido sometido previamente a pruebas de reproducibilidad intraexaminador presentando un índice Kappa de 0,80. El hueso recién formado y las partículas de injerto no incorporadas se identificaron visualmente en las imágenes y se marcaron con la herramienta de selección del software. Los errores en la selección automática se comprobaron y corrigieron manualmente. Luego, las áreas definidas de hueso nuevo se colorearon en azul, mientras que las áreas de restos de injerto no incorporados se colorearon en rojo. El etiquetado de colores permitió que las selecciones fueran más fácilmente distinguibles. La cantidad de cada parámetro se calculó como un porcentaje de toda la superficie de la imagen.

Se realizaron reacciones inmunohistoquímicas utilizando los siguientes anticuerpos primarios para evaluar la formación y remodelación ósea: anti-OCN (Osteocalcin, clon: ab10911, Millipore, Massachusetts, EE. UU., dilución 1:200), anti-OPN (Osteopontin, clon: Akm2A1, Santa Cruz Biotechnology, Inc, dilución 1:100), anti-COL 1 (Colágeno tipo 1, clon: ab90395, Abcam, Massachusetts, EE. UU., dilución 1:100) y anti-TRAP (fosfatasa ácida tartrato resistente, clon: EPR15556, Abcam, Massachusetts, EE. UU., dilución 1:200). Las secciones fueron inicialmente desparafinadas en xileno, hidratadas en concentraciones decrecientes de alcohol absoluto, 90°, 70° y sometidas a recuperación antigénica utilizando una solución tamponada de citrato de sodio 10 nM, pH 6,0 en un baño de agua a 90 °C durante 20 min. La inactivación de la peroxidasa endógena se realizó mediante inmersión de las secciones en peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos, seguida de incubación con anticuerpos primarios en una cámara húmeda, a temperatura ambiente durante 60 minutos. En todas las reacciones se incluyeron controles positivos y negativos (omisión de anticuerpos primarios), según las directrices de los fabricantes. Después de la incubación con los anticuerpos primarios, las secciones se incubaron con los anticuerpos secundarios usando un sistema de detección de antígeno inmunoenzimático libre de biotina y se revelaron con un cromógeno de diaminobencidina del mismo sistema (sistema de detección Reveal Polyvalent HRP-DAB, Cat# SPD-125, Spring Biosciences, California, Estados Unidos). Las muestras se tiñeron con hematoxilina. Utilizando microscopía óptica, se tomaron 10 campos de visión (FOV) de cada portaobjetos (que cubren toda el área injertada) con un aumento de 40X para cuantificar el número de células TRAP positivas. Las células se contaron dentro del área de cada FOV y se calculó el recuento medio para la muestra correspondiente (el recuento de células de cada muestra es el resultado de la media de sus FOV). El recuento celular medio para cada grupo se comparó entre los grupos12. Para la cuantificación de OCN, OPN y COL1, se analizaron 4 imágenes de cada muestra con un aumento de 10 × utilizando el software ImageJ (NIH). El área de reacción positiva se seleccionó con la herramienta "color umbral" y el software la calculó en píxeles. El umbral de positividad fue determinado visualmente de acuerdo por dos evaluadores ciegos diferentes y se utilizó el mismo rango de valores para evaluar todas las muestras.

El análisis estadístico se realizó mediante SPSS (IBM Analytics). El nivel de significancia se fijó en el 5% (p < 0,05). Se realizó la prueba t de Student de muestras independientes para verificar la diferencia en las variables estudiadas entre los dos tipos de injerto (A-HBG y VC-HBG) a las 4 y 8 semanas. Se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para verificar el no rechazo del supuesto de normalidad de la distribución, por lo que se utilizó una prueba paramétrica. Se utilizó el análisis de varianza de dos factores (ANOVA) para evaluar el efecto del tipo de injerto y el efecto del tiempo, además de la interacción entre ellos, en todas las variables estudiadas. Para verificar los supuestos del análisis, se evaluó la distribución de errores estandarizados mediante las pruebas de normalidad de Kolmogorov-Smirnov (con corrección de Lilliefors) y Shapiro-Wilk, además de la evaluación del Gráfico Q-Q Normal. Después del análisis de los residuos, no hubo rechazo significativo del supuesto de normalidad de la distribución de los datos por ninguna variable del estudio, validándose la prueba paramétrica utilizada.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente.

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Este estudio fue apoyado por el Centro Clínico y de Educación de Investigación Geriátrica del Sistema de Salud de VA de Miami utilizando recursos e instalaciones de VINCI, VA HSR RES 13-457. Las opiniones expresadas son las de los autores y no las del Centro Clínico y Educativo de Investigación Geriátrica o VINCI. Los materiales de injerto fueron suministrados por Vivex Biomedical, Inc. DD recibió una beca posdoctoral del Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico de Brasil (CNPq).

Estos autores contribuyeron igualmente: Daniel Deluiz y Gaëtan J.-R. Delcroix.

Departamento de Periodoncia, Universidad Estatal de Río de Janeiro, Boulevard 28 de Setembro, 157 - 2do piso - sala 10, Río de Janeiro, RJ, CEP 20551-030, Brasil

Daniel Deluiz, Samira RG Fraga y Edward MB Tinoco

Departamento de Ortopedia, Universidad de Miami, Miami, FL, EE. UU.

Daniel Deluiz

Facultad de Medicina Alopática, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, FL, EE. UU.

Gaëtan J.-R. Delcroix

Centro clínico y educativo de investigación geriátrica, Miami VA Healthcare System, Miami, FL, EE. UU.

Gaëtan J.-R. Delcroix, Cristina Grau-Monge, Andrea Bonnin-Márquez, Teresita Reiner y Paul Christian Schiller

Departamento de Ingeniería Biomédica, Facultad de Ingeniería, Universidad de Miami, Miami, FL, EE. UU.

Gianluca D'Ippolito

Departamento de Patología y Laboratorios, Universidad Estatal de Río de Janeiro, Río de Janeiro, RJ, Brasil

Thais Amadeu

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DD diseñó el estudio, realizó las cirugías animales, recolectó las muestras y redactó el manuscrito, GJD realizó la interpretación de los datos, preparó las imágenes y redactó el manuscrito, SRGF realizó la preparación de muestras, análisis de microscopía y realizó evaluaciones estadísticas, GD desarrolló y preparó el injerto celularizado. , CGM realizó el apoyo para las cirugías y el cuidado de los animales, realizó la adquisición de imágenes y la preparación de muestras de uCT, ABM realizó la adquisición de imágenes y la preparación de muestras de uCT, TR y TA realizaron la preparación de muestras histológicas y la interpretación de datos de histología/inmunohistoquímica, PCS y EMBT coordinaron el estudio. . Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final presentado.

Correspondencia a Daniel Deluiz o Paul Christian Schiller.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Deluiz, D., Delcroix, G.JR., Fraga, SRG et al. El injerto óseo humano criopreservado viable exhibe propiedades osteogénicas superiores en el aumento lateral mandibular. Informe científico 13, 1422 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28170-6

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Recibido: 28 de octubre de 2022

Aceptado: 13 de enero de 2023

Publicado: 25 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28170-6

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