Actividad del complejo III mitocondrial: de las biopsias musculares invasivas al paciente

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 9638 (2023) Citar este artículo

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La disfunción mitocondrial inducida por fármacos es un efecto adverso común, especialmente en el caso de las estatinas, los fármacos más recetados en todo el mundo. Se ha demostrado que estos fármacos inhiben el complejo III (CIII) del proceso de fosforilación oxidativa mitocondrial, que está relacionado con el dolor muscular. Como el dolor muscular es la queja más común de los usuarios de estatinas, es fundamental distinguirlo de otras causas de mialgia para evitar el cese innecesario del tratamiento farmacológico. Sin embargo, el diagnóstico de la inhibición de CIII actualmente requiere biopsias musculares, que son invasivas y no prácticas para las pruebas de rutina. Alternativas menos invasivas para medir las actividades del complejo mitocondrial sólo están disponibles todavía para los complejos I y IV. Aquí, describimos un método espectrofotométrico no invasivo para determinar las actividades catalíticas de CIII utilizando hisopos bucales, que validamos en una cohorte de usuarios de estatinas y no estatinas. Nuestros datos indican que CIII se puede medir de manera confiable en hisopos bucales, como lo demuestran los resultados reproducibles por encima del límite de detección. Se recomienda una mayor validación en un entorno clínico a gran escala.

La miopatía mitocondrial se caracteriza típicamente por mitocondrias deterioradas morfológica y bioquímicamente, lo que resulta en una disminución de la producción de energía. Estas aberraciones tienen en su mayoría un origen genético, sin embargo, muchos fármacos también pueden inducir disfunción mitocondrial, de las cuales las estatinas son un claro ejemplo1.

Las estatinas son los medicamentos más recetados en el mundo para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, con más de 180 millones de usuarios en todo el mundo, pero su uso también está asociado con diversos efectos secundarios2,3. Se reportan quejas musculares en 7 a 29% de todos los usuarios, que varían desde rigidez muscular común hasta casos raros de rabdomiolisis que ponen en peligro la vida2,4,5,6. Anteriormente hemos demostrado que las estatinas inhiben el complejo mitocondrial III (CIII)7 y la actividad de CIII se correlaciona inversamente con la intensidad del dolor muscular en usuarios sintomáticos de estatinas8. Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que la actividad de CIII puede ser útil para identificar los síntomas musculares inducidos por estatinas (SAMS), ya que actualmente no existe ninguna prueba de diagnóstico objetiva o definitiva9,10,11. Hay muchas definiciones diferentes de SAMS y protocolos variables disponibles que evalúan la probabilidad de que las estatinas causen molestias musculares. Estos se basan en cuestionarios subjetivos (por ejemplo, SAMS-CI) o anomalías de laboratorio (indirectas) (por ejemplo, niveles elevados significativos de CK o enzimas hepáticas)10,11,12,13,14,15. Una prueba más específica para identificar SAMS sería de especial interés en el contexto del metaanálisis publicado recientemente que sugiere que la mayoría de las molestias musculares reportadas no se deben al uso de estatinas16. Se ha demostrado que otros factores como las comorbilidades (p. ej., hipotiroidismo, polimialgia reumática, deficiencia de vitamina D), actividad física intensa reciente o traumatismo, infección viral y polifarmacia inducen dolor muscular y deben distinguirse del dolor causado por el uso de estatinas12,15,17. ,18,19. Esta distinción es especialmente importante, porque la falta de adherencia al tratamiento con estatinas supone una gran carga para la morbilidad y la mortalidad cardiovascular11.

La actividad catalítica del CIII, al igual que otros complejos del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS)20,21, se determina típicamente mediante mediciones colorimétricas en biopsias musculares o fracciones celulares22. Las biopsias musculares causan una carga significativa para el sujeto23 y está disponible una alternativa menos invasiva para medir la actividad de los complejos I y IV mediante la realización de ensayos espectrofotométricos y de inmunocaptura en células recuperadas de hisopos bucales24,25,26,27. Este último método parece mostrar una buena correlación con los métodos más tradicionales, con un R2 que oscila entre 0,49 y 0,99 para las mediciones de actividad de los complejos I y IV24,25,26,27. Sin embargo, falta un ensayo similar para CIII. Aquí, adaptamos y validamos un método para medir la actividad de CIII basado en la reducción enzimática del citocromo C28, de modo que pueda usarse en lectores de microplacas de espectrofotómetro utilizando muestras de hisopos bucales no invasivos. La sensibilidad y validez de esta medición se probó en un gran grupo de sujetos de control y usuarios de estatinas con y sin molestias musculares.

En el primer montaje, la actividad de CIII se midió en hisopos bucales de personas sin deficiencia de CIII, mediante un ensayo de reducción enzimática del citocromo C, medido espectrofotométricamente en una placa de 96 pocillos. Este ensayo se basó en los datos preliminares de la Fig. 1 complementaria. Al agregar el inhibidor de CIII antimicina A (AA), se midió la reducción del citocromo C independiente de este complejo (fondo). Debido al pequeño volumen de muestra en relación con los pozos más grandes, esto resultó en actividades CIII con un alto nivel de variabilidad inter e intraexperimental (resultados no mostrados). Por lo tanto, se cultivaron células HeLa para crear series de dilución con mitocondrias de una manera más controlada, que se mantuvieron más constantes entre los diferentes experimentos. La serie de diluciones de HeLa mostró una disminución gradual en la actividad de CIII con una disminución del número de células, mientras que el fondo (reducción basal del citocromo C) permaneció igual (Fig. 1) y con poca variación dentro de las muestras. Con una dilución cinco veces (aproximadamente 0,25 millones de células), la curva se aplanó (ver parte ampliada de la Fig. 1) y alcanzó el límite de detección del ensayo. La actividad de CIII medida en el hisopo bucal fue similar a la de las células HeLa diluidas siete veces (aproximadamente 62.500 células/muestra) y, por lo tanto, quedó fuera del límite de detección.

Actividad de CIII en series de diluciones de células HeLa en comparación con muestras de hisopo bucal de una persona sin deficiencia de CIII según la falta de síntomas. La actividad CIII expresada en mU mL-1; media ± SEM con puntos de datos individuales trazados. Las series de dilución de las células HeLa provienen de un vial; el número de células (en millones) se muestra en el eje x. Se utilizó una muestra de cuatro hisopos como se mencionó anteriormente. AA (antimicina A, azul claro) fue la capacidad de reducción del citocromo C inhibida o basal para cada condición. Si la curva dependiente de la concentración alcanzaba una meseta, las mediciones se consideraban iguales al fondo (= alrededor de 62.500 células).

La serie de diluciones de células HeLa mostró que el ensayo espectrométrico de actividad enzimática CIII se vuelve inexacto alrededor de la fase de meseta de 62.500 células/muestra. Como la actividad de CIII en los hisopos bucales rondaba este nivel y, por lo tanto, no era confiable, se adoptaron mediciones de fluorescencia para mejorar la precisión en límites de detección más bajos. La Figura 2A representa los resultados de la actividad CIII en una serie de diluciones de células HeLa que miden la reducción del citocromo C con fluorescencia. La pendiente determinada cruza el eje x alrededor de 4 a 5 millones de células HeLa, lo que sugiere que cualquier valor por debajo de este nivel es inexacto. Los hisopos de personas sin deficiencia de CIII (no representados) tenían una actividad de CIII comparable a 0,5 a 1 millón de células HeLa. Para mejorar aún más el límite de detección, debido al contenido limitado de células en los hisopos bucales, se aumentó la relación entre la mezcla de reacción y el contenido mitocondrial. Para evitar tener muy poco volumen en cada pocillo (< 100 µL), también se redujo el tamaño del pocillo. El aumento de la fracción celular y mitocondrial (de 1:2 a 1:1) mediante el uso de una placa de 384 pocillos dio como resultado una relación lineal entre la actividad de CIII y la serie de dilución de células HeLa (Fig. 2B). Se observó una respuesta similar para las actividades de CIII en réplicas biológicamente independientes (Fig. 2C).

Actividades CIII basadas en fluorescencia y espectrofotometría en series de dilución de HeLa. Medición de fluorescencia en placa de 96 pocillos (A) y placa de 384 pocillos (B, C) y mediciones espectrométricas en placa de 384 pocillos (D) de series de dilución de células HeLa (en millones de células) y muestra de hisopo de cuatro hisopos agrupados. Los resultados se presentan como media ± SEM. Las líneas negras son las curvas de regresión lineal dibujadas a través de todos los puntos. Las diluciones (en millones de células HeLa) debajo de la intersección de esta línea de regresión y el eje x representan el rango de trabajo mínimo. La línea de puntos roja es el nivel de actividad de CIII para una muestra de hisopo de una persona sin deficiencia de CIII. Si esta línea se cruza con la línea de regresión sobre la intersección con el eje x, se consideró que los resultados estaban por encima del límite de detección del ensayo.

Dado que el inhibidor de CIII AA, que es necesario para bloquear la reducción enzimática del citocromo C, reveló propiedades autofluorescentes (datos no mostrados), volvimos al ensayo espectrofotométrico de CIII. Para aumentar la concentración mitocondrial, se eligió una placa de 384 pocillos en lugar de 96 (Fig. 2D). Los resultados de tres experimentos biológicamente independientes mostraron una actividad CIII dependiente de la concentración comparable al ensayo fluorescente (Fig. 3). Los resultados obtenidos con las muestras de hisopos bucales de personas con CIII no deficiente también estuvieron claramente por encima del límite de detección en los tres experimentos (actividad de CIII por encima de la fase meseta en células HeLa).

Actividades de CIII en series de diluciones de HeLa en placas de 384 pocillos medidas con espectrofotometría. Mediciones espectrofotométricas de la dilución de células HeLa (en millones de células) y cuatro hisopos agrupados como muestra de hisopo en una placa de 384 pocillos. Resultados agrupados de tres experimentos biológicamente independientes. Los resultados se presentan como media ± SEM con puntos de datos individuales representados. La muestra de hisopo se encuentra dentro del rango de trabajo del ensayo si la barra está por encima de los valores más bajos de células HeLa que no mostraron una mayor disminución en la actividad de CIII después de aumentar las diluciones (fondo desde la dilución 0,333 en adelante).

El coeficiente de variación (CV) entre e intraensayos para las células HeLa fue del 33,7% y el 26,5%, respectivamente. El CV intraensayo para los hisopos estuvo en línea con el de las células HeLa (32,5%). Sin embargo, el CV entre ensayos para los hisopos bucales fue bastante alto (61,9%) (Fig. 4). Esta variabilidad se corrigió mediante mediciones de citrato sintasa (CS), un método bien establecido para ajustar la variabilidad en el número de células y el contenido mitocondrial obtenido de hisopos bucales23,24,29. Después de la corrección de CS, el CV entre ensayos para hisopos bucales se redujo al 44,7 %. La corrección por niveles de proteína utilizando el ensayo de Bradford o el kit de proteínas Pierce™ BCA (Thermofisher) fue inferior a la CS y, por lo tanto, no se aplicó más (resultados no mostrados)30,31.

Coeficiente de variación para actividades espectrofotométricas de CIII en células e hisopos HeLa. Mediciones espectrofotométricas para la actividad CIII de células HeLa y muestras de hisopo (sin corregir) y corregidas para la actividad de citrato sintasa en muestras de hisopo (b). Los resultados provienen de tres experimentos individuales (N = 1–3) y combinados (media). Los resultados se presentan como media ± SEM con puntos de datos individuales representados. Se muestra el coeficiente de variación (CV) entre ensayos. CS citrato sintasa.

La actividad de CIII se examinó en 69 participantes que recibieron tratamiento con estatinas, con (n = 35) y sin molestias musculares (n = 34) y sujetos de control sin estatinas (n = 31). Se excluyeron trece participantes debido a una actividad de CIII inconmensurablemente baja, incluidos nueve usuarios de estatinas (tres sintomáticos y seis asintomáticos) y cuatro controles. Las características iniciales de los 87 participantes restantes se muestran en la Tabla 1. Los usuarios de estatinas sintomáticos eran significativamente más jóvenes en comparación con los usuarios de estatinas de control y asintomáticos (p = 0,022). Todas las demás características iniciales fueron similares entre los grupos.

Las actividades medias de CIII corregidas por CS no fueron diferentes entre los usuarios de estatinas y los sujetos de control (respectivamente 900 ± 80 versus 750 ± 130 mU U-1 CS; p = 0,326). Tampoco hubo diferencias en la actividad de CIII corregida por CS entre los usuarios de estatinas sintomáticos y asintomáticos (respectivamente 910 ± 110 y 890 ± 130 mU U-1 CS; p = 0,930), y no se observaron diferencias entre el grupo de estatinas y el grupo de control ( respectivamente p = 0,362 y p = 0,442) (Fig. 5a, b). La actividad de CS no difirió significativamente entre los usuarios de control y de estatinas (tanto sintomáticos como asintomáticos) (Fig. 5c, d). Sin embargo, la actividad de CIII se correlacionó significativamente con la actividad de CS (p <0,001, r = 0,565).

La actividad de CS corrigió la actividad de CIII y la actividad de CS en muestras de hisopos bucales de participantes de las Marchas de los Cuatro Días de Nijmegen. (a) CIII y (c) CS en pacientes tratados con estatinas (n = 60) y controles (n = 27) y (b) CIII y (d) CS en usuarios de estatinas con molestias musculares (n = 32), sin quejas (n = 28) y no usuarios de estatinas (n = 27). La actividad se midió como la absorbancia de la reacción de reducción del citocromo c y se normalizó mediante la actividad de la citrato sintasa (CS) o como la actividad CS sola. No se encontraron diferencias estadísticas. Los datos se presentan como media ± SEM con puntos de datos individuales trazados.

Las molestias musculares inducidas por las estatinas son una razón importante para suspender las estatinas y parecen estar asociadas con disfunción mitocondrial, que podría deberse a la inhibición de CIII inducida por las estatinas2,7,32. La evaluación actual de las deficiencias o inhibiciones del complejo mitocondrial requiere biopsias musculares invasivas33,34. Se están explorando nuevos enfoques no invasivos para investigar la disfunción mitocondrial específica de complejos24,26. Se han utilizado hisopos bucales para medir cambios en las actividades del complejo mitocondrial I y IV después del tratamiento farmacológico. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo de prueba para un ensayo de función CIII mitocondrial utilizando hisopos bucales, que se validó en una población con y sin molestias musculares inducidas por estatinas.

La actividad de CIII medida con hisopos bucales de personas con CIII no deficiente según la sintomatología produjo resultados consistentes por encima de los límites de detección del ensayo (> 0,2 mU ml-1). Este límite de detección se basó en mediciones de CIII a partir de diluciones de números controlados de células HeLa. Se estableció justo por encima de los valores de CIII más bajos que no mostraron una mayor disminución en la actividad de CIII (que representa la medición de fondo). La corrección de la actividad CS redujo aún más la variabilidad del ensayo en hisopos bucales. Las muestras de usuarios y no usuarios de estatinas, utilizadas para el experimento de validación, arrojaron una actividad CIII notable pero no significativamente mayor en los usuarios de estatinas en comparación con los no usuarios. Esto fue opuesto a lo observado en biopsias musculares de usuarios de estatinas7,8 y no estaba relacionado con el contenido mitocondrial, ya que no se observaron diferencias en la actividad CS entre los usuarios de estatinas y los no usuarios29. Además, no hubo correlación entre la actividad de CIII o CS y el uso de estatinas o las molestias musculares.

El ensayo espectrofotométrico de actividad enzimática CIII se basó en métodos previamente informados desarrollados para otros complejos mitocondriales (I y IV)24,26,27. Para CI y CIV, estos incluyen ensayos con tira reactiva que utilizan inmunocaptura de CI y CIV que se utilizan posteriormente para impulsar una reacción enzimática cuyo precipitado coloreado se cuantifica26. Falta un método de tira reactiva similar para CIII, razón por la cual desarrollamos otro ensayo para medir la actividad de CIII. Basamos la solución tampón de extracción y el protocolo para la preparación de la fracción mitocondrial en estos ensayos con tira reactiva, con la adición de un paso de mejora para aumentar aún más el rendimiento (datos no mostrados) y, en consecuencia, mejorar la sensibilidad35,36. Una desventaja de nuestro ensayo es que no se basa en inmunocaptura, lo que podría explicar el mayor coeficiente de variaciones que observamos (alrededor del 39 % frente al 10 % en la literatura) y la actividad superpuesta de CIII entre usuarios y no usuarios de estatinas26,37,38 .

Un reciente artículo de revisión sobre la selección de muestras y elección de prueba para estudiar la bioenergética mitocondrial en material humano34, también destaca las limitaciones del tamaño de la muestra a la hora de elegir una alternativa a la biopsia muscular. Abordan el desafío de muchas técnicas prometedoras que utilizan plaquetas o leucocitos debido a la imposibilidad de aumentar la reproducibilidad o la dificultad de ampliarlas. Dos mejoras al ensayo con hisopo bucal podrían ser la respirometría en muestras congeladas y la eliminación de bacterias de las muestras, ya que se ha demostrado que la contaminación bacteriana altera las mediciones y disminuye la especificidad34,39,40,41.

Las limitaciones de este estudio son que no pudimos obtener biopsias musculares de usuarios y no estatinas utilizando controles para la validación entre tejidos de la actividad CIII. También es necesaria una interpretación cuidadosa de los datos debido a la alta tasa de renovación de la capa epitelial oral. La inhibición de CIII inducida por estatinas es en parte consecuencia de la exposición prolongada del tejido muscular a las estatinas y, por lo tanto, está asociada con la acumulación intramiocelular de estatinas debido a un recambio proteico más lento en este tejido42,43. Por otro lado, la capa epitelial oral con células de la mucosa bucal tiene una alta tasa de renovación celular de aproximadamente 2,7 h44. Como consecuencia, hay un tiempo limitado disponible para que las estatinas se acumulen y, por lo tanto, sigue siendo cuestionable si los hisopos bucales son un sustituto adecuado de las biopsias musculares en el diagnóstico de la inhibición de CIII inducida por estatinas.

El muestreo y el procesamiento de hisopos bucales también podrían optimizarse aún más. La presencia de trazas de glóbulos rojos en las muestras se asoció con niveles más altos de actividad de CIII y CS. Dado que la absorbancia de CIII se midió en una longitud de onda que coincidía tanto con la reducción del citocromo c como con la hemoglobina de los glóbulos rojos (550 nm, luz roja), la presencia de sangre podría haber aumentado falsamente la señal45. Como las mediciones de CS utilizan una longitud de onda que también está muy próxima a la absorbancia de la hemoglobina (412 frente a 550 nm), es insuficiente para corregir rastros de sangre45. Por lo tanto, las muestras que contenían trazas de sangre (hemoglobina) tuvieron que ser excluidas mediante inspección visual. Otro factor es la fase de procesamiento de los hisopos bucales hasta el aislamiento mitocondrial, ya que esto se ha adaptado con el tiempo con la adición de cerámica y tiempos de giro más prolongados para mejorar la sensibilidad del ensayo. Sin embargo, las muestras de validación se procesaron según uno de los primeros protocolos y, por lo tanto, su rendimiento podría haber sido demasiado bajo, lo que dio lugar a mediciones por debajo de los límites de detección del ensayo. Además, un total de 13 pacientes (13%) fueron excluidos debido a actividades de CIII extremadamente bajas, aunque se distribuyeron uniformemente entre los usuarios de estatinas (tres sintomáticos y seis asintomáticos) y los controles (cuatro).

Este estudio es un paso hacia el desarrollo futuro de un ensayo con tira reactiva más sensible. El ensayo actual utiliza hisopos bucales menos invasivos para medir las actividades mitocondriales de CIII de manera consistente. Incluir un método de inmunocaptura, junto con mejorar la adquisición de muestras sin sangre y la purificación de muestras con cerámica, podría disminuir aún más la variación del ensayo. Las mediciones de reacción enzimática y espectrofotometría adquiridas aquí también son aplicables en un ensayo con tira reactiva como se aplican para los complejos I y IV24,26. Además, vale la pena estudiar la posibilidad de realizar mediciones en muestras congeladas y optimizar la eliminación de bacterias. Entonces podría recomendarse utilizar pacientes con deficiencia de CIII conocida para evaluar la correlación con este defecto mitocondrial previamente diagnosticado como se hizo para CI y CIV24,26 o evaluar la actividad de CIII mediante hisopos de pacientes con inhibición de CIII inducida por fármacos comprobada mediante biopsia en el esqueleto. músculo. Se debate si las estatinas son la causa del SAMS informado16,46. La optimización del ensayo actual podría ayudar a distinguir entre los síntomas musculares debidos a la inhibición de CIII inducida por estatinas o a otras causas7.

El protocolo descrito actualmente puede medir adecuadamente los niveles de actividad del complejo III mitocondrial de forma no invasiva, aunque necesita una mayor optimización y validación en un entorno clínico.

2-Amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol (TRIS UltraPure) (Invitrogen, n.º 15504020); Antimicina A (Sigma-Aldrich, n.° A8674); Citocromo C (Sigma-Aldrich, n.º C7752); 2,3-dimetoxi-5-metil-6-decil-1,4-benzoquinona (Decilubiquinona) (Enzo Life Sciences, n.º BML-CM115-0010); fosfato de potasio dibásico (Sigma-Aldrich, n.º P3786-M); fosfato de potasio monobásico (Acros Organics, #205925000); Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich, n.º 276855); ácido etilendiaminotetraacético, 2Na (Na-EDTA) (Merck, n.° 324503); heparina (Sigma-Aldrich, #H3393); Etanol (Merck, n.° 100983); borohidruro de potasio (Sigma-Aldrich, n.º 60080); Azida de sodio (Sigma-Aldrich, #S2002); sacarosa (Acros Organics, n.º 220900025); Tween-20 (Sigma-Aldrich, #P1379); Ácido clorhídrico fumante (37%) (Merck, n.° 100317); hidróxido de potasio (Merck, n.° 105032); n-dodecil β-d-maltósido (Sigma-Aldrich, n.º D4641); Cloruro de sodio (Sigma-Aldrich, #S9888); HEPES (Sigma-Aldrich, #H3375); cOmplete™, mini, cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA (Sigma-Aldrich, n.º 11836170001); hisopos bucales de ADN/ARN (Isohelix™, n.º SK-1S); DMEM, glucosa alta, suplemento GlutaMAX™, piruvato (Gibco™ Life Technologies, n.º 31966047); suero bovino fetal (FBS; Greiner Bio-One, Alpen aan de Rijn, Países Bajos, n.º 758093); Solución salina tamponada con fosfato 1 × (PBS; soporte de laboratorio y preparación del medio LEM, RIMLS, Radboudumc, Nijmegen, Países Bajos); Tripsina-EDTA al 0,05 % (1×) (Gibco™ Life Technologies, n.º 25300054).

Las células HeLa (American Type Culture Collection, CCL-2) se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % (v/v) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía glucosa 25 mM, GlutaMAX™, piruvato 1 mM. suplementado con 10% (v/v) de FBS. Si eran confluentes, las células se lavaron con PBS, se disociaron con tripsina y, después de 6 a 7 minutos de incubación a 37 ° C, se pasaron en una proporción de 1:10. Las células también se centrifugaron (5 min, 1000 g) y se resuspendieron en DMEM para su recuento. Las células se dividieron en tubos Eppendorf de 1,5 ml, aproximadamente 8 millones de células/tubo, y se centrifugaron nuevamente antes de congelarlas rápidamente en nitrógeno líquido. Estas células se almacenaron a -20 °C para experimentos.

Por cada paciente se obtienen al menos 4 hisopos bucales. Es importante enjuagarse la boca antes de recolectar las muestras para evitar que cualquier residuo de comida o bebida altere la muestra. A continuación, cada hisopo se coloca en 175 µl de tampón de extracción (pH 7,4) que consiste en lauril maltósido (dodecil maltósido) (1,5 % p/v), NaCl 100 mM, HEPES 25 mM y una tableta de cóctel inhibidor de proteasa. Cada hisopo bucal se agita brevemente (aproximadamente 20 s) y se centrifuga en una centrífuga enfriada a 4 ° C durante 5 minutos, 8500 g. Los sobrenadantes y los gránulos de cuatro hisopos bucales se combinan y se suspenden en 1 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,4). Esta suspensión de Tris-HCl-Swab se mezcla de 6 a 8 veces y luego se incuba en hielo durante 20 minutos. A continuación, los tubos se centrifugan en una centrífuga enfriada a 4 °C durante 20 minutos, 16.000 g. Todas las fracciones celulares se recogen en el sedimento y se descartan y el sobrenadante con mitocondrias se utiliza para los siguientes análisis.

Las mediciones de la actividad CIII se determinan mediante un ensayo espectrofotométrico basado en la siguiente reacción enzimática: DUH2 + citocromo c (oxidado) → DU + citocromo c (reducido) + 2H+.

Para la configuración de 96 pocillos: en una microplaca transparente de fondo F de 96 pocillos (Greiner Bio-One, Essen, Alemania), se pipetean 72,5 l de mezcla de reacción en cada pocillo. La mezcla de reacción se prepara nuevamente el día de los experimentos y consta de Milli-Q (14,6 % v/v), tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,8; 66,4 % v/v), NaN3 0,3 M (1,3 % v/v). ), Na-EDTA 0,1 M (1,3% v/v), Tween-20 2% (2,7% v/v), citocromo C 1 mM (13,3% v/v) y DUH2 reducido (0,4% v/v). Agregue el DUH2 5 minutos antes de su uso e incube en hielo para evitar la precipitación. Se añaden 2,5 µl de Milli-Q (MQ) o antimicina A (AA; concentración mínima de 10 nM) respectivamente a los pocillos de actividad o en blanco. AA es un inhibidor de CIII y se utiliza para medir la reducción basal del citocromo C (fondo) para determinar la actividad real de CIII.

Para la configuración de 384 pocillos: en una microplaca de fondo negro/claro de 384 pocillos (Greiner Bio-One, Essen, Alemania) se colocan 40 ml de mezcla de reacción en cada pocillo. Esta mezcla de reacción no tiene citocromo C: Milli-Q (16,8 % v/v), tampón fosfato de potasio 50 mM (pH 7,8; 76,6 % v/v), NaN3 0,3 M (1,5 % v/v), Na- EDTA (1,5% v/v), 2% Tween-20 (3,1% v/v) y DUH2 reducido (0,4% v/v). Se añaden 5 µl de MQ o AA (concentración mínima de 10 nM) respectivamente a los pocillos de actividad o en blanco.

Para ambos ensayos (después de agregar AA o MQ): la placa se coloca en un lector de placas Bio-Rad Benchmark Plus con el software Microplate Manager 5.2 Build 103 (Bio-Rad Laboratories BV, Veenendaal, Países Bajos) para calentar y mezclar. (25 ºC). Después de 5 minutos, se añaden 25 µl (configuración de 96 pocillos) o 40 µl (configuración de 384 pocillos) de muestra. La reacción catalítica recién comenzó en la configuración de 384 pocillos mediante la adición de 7,7 μl de citocromo c oxidado 1 mM y la formación de citocromo c reducido se midió a 550 nm a 25 °C en el lector de placas. El citocromo C ya se añadió en la configuración de 96 pocillos como componente de la mezcla de reacción. Las mediciones cinéticas se tomaron cada 20 s durante una duración total de 20 min.

Los experimentos se realizaron por triplicado, la diferencia obtenida entre la muestra y el blanco representa la actividad de CIII. Para ello, las mediciones se trazan en una curva de tiempo y se calcula una pendiente para, como mínimo, los primeros 10 puntos de datos en Graphpad Prism. Se excluyeron los valores atípicos. La pendiente se utiliza en la siguiente fórmula para calcular la actividad CIII.

ΔE min-1: aumento promedio de la absorción a 550 nm por minuto en la muestra de reacción; Dilución: dilución de la fracción mitocondrial, si no está diluida mantenerla en 1; T: volumen total de reacción (en µL), normalmente 92,7 µL; x: volumen de fracción mitocondrial añadida en µL, normalmente 40 µL; 0,0191 µmol-1 cm-1: e550 nm de citocromo c reducido.

El promedio de los pocillos de control negativo (sin células) se resta de todos los demás valores de actividad. A continuación, la actividad absoluta = actividad de los pocillos experimentales (MQ) - actividad de los pocillos en blanco (AA). Las actividades CIII se consideran inválidas cuando son iguales o inferiores a 0.

La citrato sintasa (CS) es una enzima mitocondrial única y, por lo tanto, un marcador de masa mitocondrial. Se utiliza como factor de corrección para la variabilidad en el contenido celular recuperado por hisopos bucales. Las mediciones de proteínas anteriores no pudieron reducir suficientemente el coeficiente de variación.

La actividad CS se determinó mediante un ensayo espectrofotométrico, basado en las siguientes reacciones enzimáticas: acetil-CoA + Oxalacetato + H2O ↔ Citrato + CoASH + H+ y CoASH + DTNB ↔ DTNB-SH + CoA.

Se utiliza el sobrenadante con fracción mitocondrial obtenido previamente (para mediciones de CIII) y se añaden 50 µL en cada pocillo de una microplaca de 384 pocillos. Todos los reactivos se disuelven en Tris-HCl 10 mM (pH 7,6). La mezcla de ensayo, que contiene 2 ml de Milli-Q, 500 µl de DTNB 1 mM y 10,42 µl de Triton X-100 al 10 %, se añade en 41,7 µl del pocillo-1. Finalmente, se añaden 5,6 l de acetil CoA 3 mM. La producción basal de DTNB-SH se midió a 412 nm durante 20 minutos (cinética) en un lector de placas Bio-Rad Benchmark Plus con el software Microplate Manager 5.2 Build 103. Posteriormente, se agregaron 2,8 μL de oxalacetato 10 mM para iniciar la reacción catalítica y, después de mezclar, se midió la producción de DTNB-SH a 412 nm durante otros 20 min (cinética). La diferencia entre las pendientes determinadas para ambas mediciones trazadas en GraphPad Prism dio como resultado la actividad CS por muestra.

Los valores de CIII obtenidos se dividen por los valores de actividad de CS, lo que da como resultado la actividad de CIII corregida.

Las muestras anteriores también se midieron en el lector de microplacas SpectraMax iD5 (Molecular Devices; San José, CA), para determinar la fluorescencia de la reducción del citocromo C. Las longitudes de onda fueron 350 nm y 450 nm para excitación y emisión, respectivamente47.

En el estudio se incluyeron cien participantes adultos de la 102ª edición de las Marchas de los Cuatro Días de Nijmegen (Nijmegen, Países Bajos). Se incluyeron usuarios de estatinas si las habían usado ≥ 3 meses antes de participar en el estudio. Los usuarios de estatinas fueron considerados sintomáticos o asintomáticos según la presencia, localización y aparición de calambres musculares, dolor y/o debilidad, utilizando el puntaje del índice clínico de mialgia de estatinas9. Se midieron el IMC, la circunferencia de la cadera y la presión arterial 1 o 2 días antes del evento (Tabla 1). Para determinar los niveles de actividad física se utilizó el Cuestionario breve para evaluar la actividad física potenciadora de la salud (SQUASH)48. Se pidió a los participantes que recolectaran cuatro hisopos bucales. La recolección de muestra se realizó durante 30 s por hisopo, en ayunas y después de enjuagar la boca dos veces. Las muestras de hisopo bucal se recolectaron como medición adicional durante un ensayo más amplio, que está registrado en ClinicalTrials.gov (NCT05011643). El estudio fue aprobado por el comité de ética médica del centro médico universitario de Radboud y los participantes dieron su consentimiento informado por escrito. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes del centro médico de la universidad de Radboud. La recolección de muestras de hisopos bucales y los cuestionarios se obtuvieron 1 o 2 días antes del evento.

Las muestras se colocaron en tampón de extracción a 4 °C (ver arriba), se agitaron durante 20 segundos y se centrifugaron durante 5 minutos (8500 g, 4 °C). El sobrenadante se aisló y se incubó en hielo durante 15 min. Para aislar las mitocondrias, las muestras se centrifugaron durante 12 min (16.000 g, 4 °C). Para cada participante, las muestras se combinaron, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta que se realizaron las mediciones de CIII.

Todos los datos se analizan utilizando GraphPad Prism versión 5.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.) e IBM SPSS® Statistics (versión 25, Armonk, NY, Estados Unidos). Los resultados se presentan como media con error estándar de la media (± SEM). La actividad CIII y la actividad CS se determinan como se describe anteriormente. Los datos se corrigieron en blanco y se normalizaron utilizando estas mediciones de actividad CS.

El coeficiente de variación intraensayo se calcula en función del coeficiente de variación de cada condición por experimento biológicamente independiente. El coeficiente de variación entre ensayos se calcula en función de la media de tres réplicas por condición de cada experimento.

Se excluyeron los pacientes con una actividad CIII media negativa. La información sobre el uso de estatinas fue cegada a los investigadores hasta que se realizó el análisis estadístico. Las diferencias entre los usuarios de estatinas y los sujetos de control se analizaron mediante una prueba t para muestras independientes. Las diferencias entre los usuarios de estatinas con síntomas musculares, los usuarios asintomáticos de estatinas y los no usuarios de estatinas se determinaron mediante la prueba de χ2 y ANOVA unidireccional. Se realizaron pruebas post hoc de Bonferroni para corregir comparaciones múltiples. Se utilizó un nivel "α" de 0,05 para determinar la significación estadística. Las correlaciones se examinaron mediante una prueba rho de Spearman no paramétrica de dos colas y fueron significativas a un nivel de 0,01.

Todos los datos utilizados en este estudio están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Descargar referencias

Los autores desean agradecer a Tom van Haaren por su contribución en la recopilación y análisis de los datos del estudio piloto y a Charlotte Hoogstraten por procesar los hisopos recién tomados y almacenarlos adecuadamente.

Estos autores contribuyeron igualmente: Silvie Timmers y Tom JJ Schirris.

Departamento de Cirugía Cardiotorácica, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Geert Grooteplein Zuid 10, PO Box 9101, 6500 HB, Nijmegen, Países Bajos

Tim Somers, Sailay Siddiqi y Wim J. Morshuis

Departamento de Farmacología y Toxicología, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Instituto Radboud de Ciencias Biológicas Moleculares, Nijmegen, Países Bajos

Tim Somers, Margit CM Janssen, Frans GM Russel y Tom JJ Schirris

Centro Radboud de Medicina Mitocondrial, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Instituto Radboud de Ciencias Biológicas Moleculares, Nijmegen, Países Bajos

Tim Somers, Sailay Siddiqi, Frans GM Russel y Tom JJ Schirris

Departamento de Fisiología, Instituto Radboud de Ciencias de la Salud, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos

Neeltje AE Allard y María TE Hopman

Departamento de Fisiología Humana y Animal, Universidad de Wageningen, Wageningen, Países Bajos

Silvie Timmers

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Conceptualización del estudio por parte de ST y TJJS. TS, MJ y NA realizaron los experimentos. TJJS recogió las muestras. TJJS realizó un estudio piloto. TS, NA, MJ, ST y TJJS analizaron los datos e interpretaron los resultados. TS escribió el manuscrito. TS preparó las cifras. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Tim Somers.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Somers, T., Allard, NAE, Siddiqi, S. et al. Actividad del complejo III mitocondrial: desde biopsias musculares invasivas hasta análisis de hisopos bucales fáciles de usar para el paciente. Informe científico 13, 9638 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36741-w

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Recibido: 09 de enero de 2023

Aceptado: 08 de junio de 2023

Publicado: 14 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36741-w

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