La evolución somática convergente comienza en el útero en una ribosopatía de la línea germinal.

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5092 (2023) Citar este artículo

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El seguimiento clonal de células mediante mutaciones somáticas permite la exploración de la dinámica clonal en enfermedades humanas. Aquí, realizamos la secuenciación del genoma completo de 323 colonias hematopoyéticas de 10 individuos con ribosopatía hereditaria, síndrome de Shwachman-Diamond para reconstruir filogenias hematopoyéticas. En ~30% de las colonias, identificamos mutaciones mutuamente excluyentes en TP53, EIF6, RPL5, RPL22, PRPF8, además de aberraciones en los cromosomas 7 y 15 que aumentan la dosis de los genes SBDS y EFL1, respectivamente. Las mutaciones de los genes diana comienzan en el útero, lo que resulta en una profusión de expansiones clonales, con solo unos pocos linajes de células madre hematopoyéticas (media 8, rango 1-24) que contribuyen con ~50 % de las colonias hematopoyéticas en 8 individuos (rango 4-100 % de clonalidad). por la edad adulta joven. La rápida expansión clonal durante la transformación de la enfermedad se asocia con mutaciones bialélicas de TP53 y una mayor carga de mutaciones. Nuestro estudio destaca cómo la mutación somática convergente de la vía de vigilancia nucleolar dependiente de p53 compensa los efectos nocivos de la ribosomopatía de la línea germinal pero aumenta las oportunidades de evolución del cáncer con mutación TP53.

Todas las células adquieren mutaciones somáticas con el tiempo a través de una variedad de procesos exógenos y endógenos que dañan el ADN. El seguimiento de tales mutaciones ha permitido la reconstrucción de historias de linaje de células madre hematopoyéticas (HSC) individuales para trazar la dinámica clonal en la hematopoyesis humana sana y maligna a lo largo de la vida1,2,3,4. Estos estudios han demostrado que algunas HSC obtienen una ventaja de aptitud física sobre otras, generalmente mediante la adquisición de ciertas mutaciones somáticas, lo que resulta en una expansión clonal lenta pero continua a lo largo de la vida3. Entre la séptima y la octava década de la vida, se produce un colapso en la diversidad clonal de HSC en la sangre con muchas expansiones clonales impulsadas por mutaciones en una variedad de genes (p. ej., DNMT3A) y cambios en el número de copias (p. ej., pérdida de Y)3,5,6 . Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre cómo difieren la selección clonal y la dinámica poblacional en individuos nacidos con mutaciones de la línea germinal que comprometen la hematopoyesis y confieren un mayor riesgo de cáncer de sangre.

El síndrome de Shwachman-Diamond (SDS) es un trastorno hereditario del ensamblaje de ribosomas causado por mutaciones heterocigotas compuestas de la línea germinal en el gen SBDS, típicamente la combinación de un alelo nulo y uno hipomórfico7,8,9. La proteína SBDS de tipo salvaje coopera con la GTPasa EFL1 para catalizar la liberación del factor antiasociación eIF6 de la cara intersubunitaria de la subunidad ribosómica grande para promover la maduración y el reciclaje de los ribosomas8,9,10,11,12. El defecto de ensamblaje de ribosomas resultante y la reducción de la síntesis de proteínas provocan insuficiencia de la médula ósea (BMF), y más de un tercio de las personas desarrollan posteriormente mielodisplasia (MDS) y leucemia mieloide aguda (LMA) en la cuarta década de la vida13,14.

A number of recurrent somatic genetic events have been identified in SDS. In individuals with one null and one hypomorphic SBDS allele on chromosome (chr) 7q, copy number neutral loss of heterozygosity (LOH) increases the gene dose of the hypomorphic SBDS allele c.258 + 2T → C and replaces the null allele15,c mutation of the SBDS gene does not promote development of myeloid malignancies in patients with Shwachman syndrome. Leukemia 23, 708–711 (2009)." href="/articles/s41467-023-40896-5#ref-CR16" id="ref-link-section-d370689391e930"> 16. De manera similar, la disomía uniparental puede ocurrir en chr15 para mitigar las combinaciones de mutaciones heterocigotas compuestas más dañinas de EFL1 en SDS17. La deleción de Chr20q y las mutaciones puntuales de EIF6 también reducen la dosis de eIF6 y/o su afinidad por el ribosoma14,18,19,20,21. Es probable que cada uno de estos eventos genéticos compense la función defectuosa del SBDS en el SDS al restaurar la homeostasis de los ribosomas.

El ensamblaje de ribosomas deteriorado estabiliza la proteína supresora de tumores p53 a través de la vía de vigilancia nucleolar (NSP)22. Se observa una mayor expresión de p53 en células hematopoyéticas de individuos con SDS23 y la alteración dirigida de Sbds en modelos murinos provoca una inducción de apoptosis dependiente de p53 en células progenitoras hematopoyéticas24,25. De hecho, las mutaciones de TP53 son recurrentes entre y dentro de los individuos con SDS18,26. Dado que TP53 es el gen alterado con mayor frecuencia en los tumores humanos27, con mutaciones que surgen tanto en las primeras etapas de la tumorigénesis, como en el glioblastoma y el cáncer de ovario28,29,30, como también en las etapas tardías de la progresión del cáncer28,31, es fundamental comprender el impacto de Mutaciones de TP53 en la competencia celular. SDS proporciona una ventana única para comprender las primeras etapas de la selección clonal mutada en TP53 debido a la presión selectiva impuesta por la mutación SBDS de la línea germinal.

En este estudio, utilizamos la secuenciación del genoma completo (WGS) de colonias hematopoyéticas derivadas de células individuales para interrogar las consecuencias mutacionales, el panorama de selección y la dinámica clonal en la ribosomopatía de la línea germinal, SDS. Mostramos que TP53 y la vía de estrés nucleolar dependiente de p53 son un objetivo frecuente de mutación somática convergente y mutuamente excluyente desde las primeras etapas de la vida, incluso en el útero. Estas mutaciones provocan una pérdida temprana de diversidad clonal que, si bien contrarresta los efectos nocivos del ensamblaje defectuoso de ribosomas, aumenta la propensión a la evolución del cáncer con mutación TP53.

Estudiamos a diez personas con SDS de entre 4 y 33 años de edad, que albergaban mutaciones bialélicas de pérdida de función de la línea germinal en el gen SBDS. Aislamos células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) y células mononucleares (MNC) de sangre periférica o médula ósea de individuos, y luego de la secuenciación del genoma completo de colonias derivadas de células individuales (n = 323), utilizamos las mutaciones somáticas. para reconstruir filogenias hematopoyéticas, utilizando metodología publicada4 (Fig. 1a, b). Los individuos tenían características clínicas típicas del SDS, incluyendo neutropenia, insuficiencia pancreática y osteopenia, que se presentaban temprano en la vida con retraso del crecimiento. La histomorfología reveló hipocelularidad de la médula ósea (rango 10–40%), diseritropoyesis y disminución de la granulopoyesis con una relación mieloide-eritroide invertida (1:3–4). Un individuo (SDS8) había progresado a MDS con displasia de trilinaje poco antes del muestreo. El fenotipado por citometría de flujo de células mononucleares de médula ósea (BM) y sangre periférica (PB) mostró una frecuencia reducida de progenitores CD34+ totales en individuos con SDS (mediana 0,2%) en comparación con donantes sanos de médula ósea (mediana 7,5%) (prueba t p = 0,01 (Fig. 1c y Fig. 1 complementaria), consistente con estudios previos32. Realizamos WGS de 323 colonias individuales derivadas de células individuales sembradas a partir de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), con una profundidad media de lecturas de 20x, junto con ADN de hisopo bucal compatible como referencia de línea germinal, en todos los individuos. Las mutaciones somáticas junto con las variantes embrionarias se identificaron mediante una combinación de llamadas de mutaciones utilizando una referencia de línea germinal coincidente, así como un enfoque de llamadas de variantes no coincidentes, como se detalla en los métodos. Las colonias hematopoyéticas se derivaron clonalmente con una fracción alélica variante media (VAF) de mutación somática de> 0,4, lo que representa las mutaciones somáticas presentes en la célula única que sembró la colonia. En total, identificamos 118 564 variantes de un solo nucleótido, 6287 pequeñas inserciones y eliminaciones, 74 variantes estructurales y 5 aberraciones en el número de copias cromosómicas en toda la cohorte (Conjunto de datos complementario 1). El número de SNV por colonia por individuo osciló entre una mediana de 130 (rango 99-163) en los individuos más jóvenes (4 años de edad) y una mediana de 714 (rango 593-744) para uno de los individuos mayores (25 años de edad). con MDS (SDS8).

un esquema de diseño experimental. Se expandieron células madre y progenitoras hematopoyéticas individuales (HSPC) y células mononucleares (MNC) de sangre periférica o médula ósea de individuos con SDS en colonias in vitro y cada colonia se sometió a secuenciación del genoma completo (WGS). Se utilizaron mutaciones somáticas para reconstruir filogenias hematopoyéticas. Se investigaron el momento de la adquisición, la dinámica clonal y las consecuencias funcionales de las mutaciones conductoras asociadas con el SDS. Paisaje de tinta. b Edad en el momento del muestreo y genotipo SBDS de cada individuo con SDS. Las dos columnas bicolores representan los dos alelos parentales, y todos los individuos tienen mutaciones bialélicas de la línea germinal en SBDS. Se midió la frecuencia de HSPC CD34+ en las muestras resaltadas (SDS2, SDS7, SDS9 y SDS10), como se muestra en (c). N el número de colonias hematopoyéticas analizadas por individuo. c La frecuencia de HSPC CD34+ en muestras de médula ósea (expresada como% del total de CMN viables) se analizó mediante citometría de flujo en cuatro de los individuos con SDS y tres individuos sanos (negros). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se utilizaron mutaciones somáticas de colonias individuales para reconstruir árboles filogenéticos de hematopoyesis (Fig. 2). Identificamos una profusión de expansiones clonales en 7 de 10 individuos (SDS2, SDS4, SDS5, SDS6, SDS7, SDS8 y SDS10), una observación muy poco característica de la hematopoyesis sana en individuos <70 años de edad o individuos con cánceres de sangre estudiados hasta la fecha1 ,3,4. Dado que al nacer, las células sanguíneas normalmente ya han adquirido alrededor de 50 a 65 mutaciones somáticas, definimos las expansiones clonales post embrionarias como cualquier clado que comprenda ≥2 colonias, cuyo ancestro común se observó después de 75 mutaciones desde el inicio de los árboles filogenéticos. Identificamos 18 expansiones clonales de diferentes tamaños en los árboles, que representan el 21% de las colonias (Figura complementaria 2 y Conjunto de datos complementario 2).

Árboles filogenéticos de colonias hematopoyéticas de diez individuos con SDS. Cada individuo tenía entre 10 y 100 colonias secuenciadas e incluidas para el análisis filogenético. Las ramas con mutaciones somáticas en genes conductores previamente reportados y/o bajo selección positiva en este estudio están coloreadas. Las ramas con mutaciones conductoras conocidas de la hematopoyesis clonal se muestran en negro y las asociadas con SDS en otros colores. La rama que alberga la mutación conductora se muestra con una línea de color más gruesa. El eje Y muestra el número total de mutaciones somáticas, incluidas las mutaciones conductoras. Las filas debajo de los árboles filogenéticos muestran las mutaciones impulsoras específicas, y las colonias albergan esa mutación con colores más densos. Es de destacar que no se detectaron mutaciones conductoras conocidas entre las mutaciones somáticas encontradas en SDS1 y SDS3. *SDS8 fue diagnosticado con transformación a mielodisplasia con displasia de trilinaje 1 mes antes del muestreo. Todas las colonias SDS8 tenían un cariotipo complejo con muchas aberraciones en el número de copias (CNA) cromosómicas (Chr). En el árbol se muestran las CNA compartidas con confianza entre las colonias SDS8.

La ribosomopatía congénita SDS proporciona una fuerte presión selectiva para la expansión de las HSC que han acumulado mutaciones somáticas que mejoran la aptitud14,15,17,18,19,20,21,26. Observamos varios eventos genómicos que se dirigen directamente al SBDS, identificando cuatro instancias de chr7q LOH, cada una de las cuales da como resultado una copia adicional del alelo SBDS hipomórfico mutante del sitio de empalme del donante c.258 + 2T > C (SDS5, 4, 7, Fig. 2). y una mutación SBDS no sinónima adquirida somáticamente, que también ocurre en el alelo hipomórfico (SDS10, Fig. 2). También identificamos un evento chr15 (tetra 15q24-26) que duplica el número de copias del gen EFL1 ubicado en 15q25.2. Estos eventos somáticos parecen compensar directamente el defecto de la línea germinal que perjudica la cooperación entre SBDS y EFL1 necesaria para la maduración de los ribosomas8.

Más comúnmente, observamos mutaciones somáticas frecuentes y adquiridas de forma independiente que afectan a otros cinco genes. Se ha informado que tres de estos genes mutan recurrentemente en SDS (PRPF8, TP53, EIF6)18,21,26. Además, identificamos mutaciones somáticas no sinónimas bajo selección positiva en los genes RPL5 y RPL22 (relación de mutaciones normalizadas no sinónimas (dN) y sinónimas normalizadas (dS) dN:dS >1, q <0,01) (Figs. 2 y 3a). ambos codifican componentes proteicos de la subunidad ribosomal grande. En general, identificamos 24 mutaciones sin sentido independientes en TP53 (Figura complementaria 3), con diferencia el gen mutado con mayor frecuencia en la cohorte, y 1 pérdida de codón de inicio, 4 sin sentido, 2 sin sentido, 1 mutación por cambio de marco y 5 deleciones de genes en EIF6. Las mutaciones somáticas en RPL22 sugirieron pérdida de función (1 pérdida de codón de inicio, 1 sin sentido, 2 en sitio de empalme, 1 sin sentido y 2 en eliminaciones de marco), mientras que las mutaciones en RPL5 y PRPF8 fueron SNV sin sentido (n = 4 y 2 respectivamente). Las mutaciones en los genes TP53, EIF6, RPL5 y RPL22 fueron recurrentes dentro del mismo individuo, observándose 9 mutaciones TP53 diferentes en SDS5 y 5 mutaciones EIF6 independientes en SDS7 (Fig. 2). Además de mutaciones recurrentes en PRPF8, TP53, EIF6, RPL5 y RPL22, observamos mutaciones en DNMT3A, ASXL1, TET2 y RUNX1 asociadas con la hematopoyesis clonal (CH), consistente con el estudio de Kennedy et al.18. Llamamos mutaciones recurrentes en genes conocidos o asociados a SDS de CH33,34/cánceres hematológicos35 como mutaciones impulsoras (ver “Métodos”). En todos los individuos de este estudio que tenían una edad media de solo 18 años (rango de 4 a 33 años), el 31% de las colonias (101/323) albergaban una mutación conductora (Fig. 2 y Fig. 2 complementaria).

a Número de mutaciones no sinónimas en los cuatro genes bajo selección positiva significativa (relación de mutaciones no sinónimas normalizadas (dN) y mutaciones sinónimas normalizadas (dS) dN:dS > 1, q < 0,01). b Proporción de células por individuo que portan mutaciones conductoras clasificadas por gen y anomalía cromosómica. Genes CH asociados con hematopoyesis clonal, alteración del número de copias de CNA. c Momento de la división del ancestro común más reciente (MRCA) de expansiones clonales (clado que comprende 2 o más colonias) que albergan mutaciones impulsoras. Esto proporciona el último punto de tiempo (junto con el intervalo de credibilidad del 95%) en el que se adquirió la mutación del controlador, representado por el momento inferido del final de la rama compartida, pero es posible que la mutación del controlador haya ocurrido en cualquier momento a lo largo de la rama. que alberga la mutación del conductor. El panel superior ilustra la diversidad de tiempos dentro de un solo individuo (SDS5) y el panel inferior muestra el tiempo de todas las expansiones basadas en impulsores identificadas en la cohorte completa (incluido SDS5) con la excepción de SDS8. Un total de 14 sucursales que albergan mutaciones de controladores de la cohorte están programadas para su última edad de adquisición. Las barras abarcan el intervalo de credibilidad del 95% de las MRCA. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Hubo heterogeneidad tanto en la frecuencia de las mutaciones conductoras como en el grado de expansión clonal entre los individuos. No se identificaron mutaciones conductoras en 67 de 68 colonias hematopoyéticas de tres individuos (SDS1, SDS3 y SDS9). Por el contrario, el 46% de las 255 colonias restantes de 7 individuos albergaban mutaciones conductoras (mediana 48%, rango: 26-100%; Figs. 2 y 3b). Los tres individuos con escasez de mutaciones conductoras también carecían de expansiones clonales detectables (SDS1, SDS3 y SDS9). No observamos ninguna correlación entre la prevalencia de expansiones clonales o mutaciones conductoras y citopenias en el recuento de sangre periférica (Tabla complementaria 1).

Exploramos expansiones clonales que carecen de mutaciones impulsoras, así como ramas no expandidas para mutaciones somáticas en genes diana putativos adicionales. Observamos una gran expansión clonal embrionaria en SDS5 que comprende 21 colonias que albergaban una translocación cromosómica que afectaba a GPR137B, que codifica una proteína reguladora mTORC1. También se identificaron variantes somáticas no sinónimas en genes implicados en la traducción (EIF4A1 y EIF5AL1), el metabolismo del ARN (DDX23, DDX42, DDX60 y DDX39B) y las proteínas ribosómicas (RPS14 y RPS21) (Conjunto de datos complementario 1). Dado que estas mutaciones sólo se observaron en colonias individuales, su posible patogenicidad sigue sin estar clara.

Aparte de un individuo (SDS8) con evolución clonal a mutaciones bialélicas de TP53 y transformación de MDS, y un individuo (SDS5) con una mutación TET2 concurrente dentro de un clado mutado por TP53, no observamos ningún caso en el que estuviera presente más de una mutación conductora. dentro del mismo linaje (Fig. 2). Las colonias que albergaban alteraciones en el número de copias que compensaban la dosis de SBDS o EFL1 (SDS2, SDS4, SDS5 y SDS7) también eran mutuamente excluyentes con las colonias que albergaban sustituciones de nucleótidos en los genes conductores. Esto sugiere que una única mutación heterocigota en uno de varios genes diana es suficiente para proporcionar una ventaja de aptitud física en el contexto del defecto de ensamblaje de ribosomas de la línea germinal.

En total, 131 de 323 colonias (41%) estaban en un linaje expandido y/o albergaban una mutación conductora (mediana entre individuos 37%, rango 0-100%; Figura complementaria 2). Excluyendo a los 2 individuos jóvenes sin expansiones clonales o mutaciones conductoras (SDS1 y 3), una mediana de ~50% de las colonias hematopoyéticas en individuos albergaban una mutación conductora o eran parte de linajes expandidos (rango 4-100%). Suponiendo que las colonias individuales con mutaciones conductoras también representan pequeñas expansiones clonales, en promedio, 8 linajes de HSC expandidos (rango de 1 a 24 expansiones de linaje de HSC en 8 individuos) produjeron la mitad de las células hematopoyéticas muestreadas en estos individuos. La oligoclonalidad en individuos jóvenes con SDS contrasta marcadamente con la hematopoyesis sana/sin SDS, donde tal grado de expansión clonal no se observa hasta después de los 70 años3.

Debido a la adquisición lineal de mutaciones somáticas a lo largo del tiempo, podemos utilizar los árboles filogenéticos para estimar cuándo comenzaron en la vida las expansiones clonales impulsadas por mutaciones impulsoras. Esto es posible convirtiendo el número de mutaciones somáticas adquiridas por el ancestro común más reciente de una expansión clonal que comparte una mutación conductora a la edad cronológica (ver métodos). Programamos el inicio de 14 expansiones clonales diferentes impulsadas por mutaciones en TP53, RPL5, RPL22, PRPF8, EIF6, así como eventos de número de copias que afectan a SBDS y EIF6 (Fig. 3c). Exhiben una variedad de tiempos de expansión clonal a lo largo de la vida, comenzando desde las primeras etapas del útero hasta los 12 años. Con la excepción de los eventos de número de copias que afectan a SBDS y EFL1 en los cromosomas 7 y 15, los cuales parecen haber ocurrido en el útero con muy poca frecuencia. En las primeras expansiones clonales, el momento de las expansiones era independiente de los diferentes objetivos, como TP53, RPL5, RPL22, PRPF8 y EIF6 (Fig. 3c). Sin embargo, observamos que nuestro estudio está sesgado hacia la detección de adquisiciones más tempranas de mutaciones de impulsores somáticos debido a la mayor duración de la expansión clonal. Por lo tanto, es plausible que las mutaciones de los impulsores somáticos y las expansiones clonales puedan continuar más allá de la infancia, pero no sean capturadas por nuestro muestreo.

Dentro de la cohorte, un individuo (SDS8) fue diagnosticado con SMD a la edad de 25 años después del desarrollo de pancitopenia con displasia morfológica de tres linajes y aumento de reticulina en la médula ósea. El cariotipo molecular reveló mutaciones bialélicas de TP53 con un cariotipo complejo. El árbol filogenético de este individuo, reconstruido a partir de sangre <1 mes después del diagnóstico de SMD, confirmó una gran expansión clonal que dominaba el compartimento hematopoyético mieloide con colonias individuales que albergaban mutaciones concurrentes en TP53 I254F y R248Q. Las colonias con mutación bialélica de TP53 también albergaban una profusión de CNA, incluidos chr5-, 6p-, 11+, 18-, 20- y X- (Figs. 2 y 4d), muchos de los cuales también fueron confirmados mediante cariotipo clínico. Estos CNA no se observaron en otros individuos o genotipos, incluidas las colonias heterocigotas/monoalélicas con mutación de TP53 (Fig. 4d), pero son una característica bien reconocida de transformación a MDS/AML en SDS36 y son consistentes con los CNA que se Se reconoce que está asociado con clones mutantes bialélicos de TP53 en el cáncer de manera más general37,38.

a Carga de mutaciones (número de SNV) en función de la edad de diez personas con SDS. Cada círculo representa el genoma de una colonia, y las barras horizontales negras representan la carga media por individuo. Se muestran dos puntos de tiempo de SDS5 a diferentes edades. Para comparar, se muestran círculos de color negro (normal) que representan cargas de mutaciones de tres individuos hematopoyéticamente sanos (sin SDS) (datos publicados3). La línea azul representa la línea de regresión a través de las colonias de individuos con SDS. b Contexto de trinucleótidos de mutaciones somáticas. Las dos firmas mutacionales se identificaron en todos los genomas. SBS142, 43 se caracteriza por una desaminación espontánea de citosinas, y la segunda firma mutacional, denominada SBSBlood1, 2, 41, representa mutaciones típicas de mutaciones endógenas en HSC. c Número de SNV atribuibles a las firmas mutacionales SBS1 (verde) y SBSblood (azul) en cada colonia de cada individuo con SDS. Cada barra representa el genoma de una colonia. Tenga en cuenta que SDS8 tiene una carga total de mutaciones más alta debido al aumento de mutaciones en SBS1. d Variación del número de copias para dos genomas de colonias representativos con mutación heterocigota/monoalélica de TP53 (de diferentes individuos) y dos colonias relacionadas clonalmente de SDS8 con mutaciones bialélicas de TP53. La ploidía se muestra en el eje y y la ubicación genómica en el eje x, para los dos alelos parentales (verde y rojo). Aberración del número de copia de CNA. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La carga de mutaciones en las colonias de SDS8 fue significativamente mayor que la esperada para la edad de este individuo. Excluyendo SDS8, la acumulación de SNV en SDS en colonias, con y sin mutaciones conductoras, fue de ~15 sustituciones por año (IC95% = 13–17, modelo lineal de efectos mixtos, p = 1 × 10−13, Fig. 4a), comparable a lo informado para una hematopoyesis sana1,2,3,39,40,41. Por el contrario, la carga de SNV en las colonias SDS8 fue más del doble de lo esperado para la edad (p = 6.867e−13, media = 905, rango = 857–933, en comparación con un esperado 496, Fig. 4a, c). Para evaluar qué procesos mutacionales podrían estar impulsando este aumento en la carga mutacional en SDS8, inferimos firmas mutacionales en toda la cohorte. De manera similar a la sangre sana/sin SDS, identificamos dos firmas mutacionales: SBS142,43, caracterizada por desaminación espontánea de citosinas; y "SBSBlood", que identifica mutaciones endógenas típicas en HSC1,2,41 (Fig. 4b). Los genomas bialélicos mutados en TP53 / CNA de SDS8 tuvieron una proporción sustancialmente mayor y una carga total de mutaciones en SBS1 (media = 41%, rango = 37–45%) de lo esperado para la edad (esperado = 12%; Fig. 4c). Como se sabe que las mutaciones de SBS1 ocurren durante la división celular, este aumento en las mutaciones de SBS1 en SDS8 sugiere una expansión clonal muy rápida en comparación con otros individuos con SDS.

A continuación, exploramos cuándo pudo haber comenzado la transición a una rápida expansión clonal en SDS8 en relación con la presentación clínica con MDS. Las ramas finales más cortas de la expansión clonal en SDS8 tenían un perfil mutacional distinto (Figura complementaria 4a), caracterizado por un marcado aumento en SBS1 (65% de las mutaciones en las ramas finales, Figura complementaria 4b). El tronco compartido de la filogenia SDS8 fue más similar al espectro mutacional de otros individuos de una edad similar en el estudio, aunque con un leve aumento en SBS1 (27% de las mutaciones compartidas) (Figuras complementarias 4a, b). Esto planteó la posibilidad de que la transición de la adquisición de mutaciones normales o las tasas de división celular en SDS8 a una rápida expansión clonal ocurriera en algún punto a lo largo del tronco compartido de la filogenia de SDS8. Para estimar cuándo pudo haber ocurrido tal transición a lo largo de esta rama compartida, descompusimos el espectro mutacional de la rama compartida en la suma de dos perfiles mutacionales: el perfil de mutación de la hematopoyesis SDS observado en otros individuos SDS de una edad similar (compuesto firma SDS de edad coincidente) y el espectro mutacional en las ramas finales privadas de SDS8 (firma de transformación) como se describe en "Métodos". La combinación de estos dos perfiles reconstruyó con precisión el espectro de mutación del tronco compartido (firma SDS compuesta de la misma edad 0,80, firma de transformación 0,20, similitud de coseno 0,958, métodos, figura complementaria 4c). Esto proporciona una estimación aproximada de cuándo pudo haber comenzado el rápido crecimiento, asumiendo que esto ocurrió en un solo momento histórico y sugirió una edad de transformación muy reciente de 23,5 años (IC 95%: 19,2–24,9). Incluso el límite inferior de este rango de edad implica un rápido crecimiento clonal. Suponiendo un modelo muy simple de un solo clon que se expande a un ritmo constante hasta alcanzar la dominancia clonal (ver “Métodos”), sugeriría que este clon estaba creciendo un 5200% (150%-15,000%) por año, correspondiente al mutante HSC. El tamaño del clon se duplica aproximadamente cada 2 meses. Estos datos resaltan la posible rapidez de la transformación a SMD en este individuo con SMS y proporcionan una posible explicación para la progresión a menudo abrupta de la enfermedad que puede observarse clínicamente. Sin embargo, es importante señalar que solo hemos caracterizado la transformación a MDS en un solo individuo. Se requiere un análisis de más individuos para estimar con confianza la trayectoria hacia la transformación de la enfermedad en SDS. Es interesante destacar que no encontramos evidencia de que las colonias heterocigotas mutadas en TP53 en toda la cohorte aumentaran la carga de mutaciones (modelo lineal mixto p = 0,22, todas las comparaciones con TP53: Tukey p ≥ 0,87), lo que sugiere que la rápida expansión clonal y las aberraciones en el número de copias observadas en SDS8 fueron impulsados ​​por la mutación bialélica de TP53 y/o las aberraciones cromosómicas presentes.

Las mutaciones en el gen EIF6 confieren una ventaja de aptitud física a las células deficientes en SBDS8,18,21,44. De los 13 eventos mutacionales de EIF6 identificados, se observaron pérdida del codón de inicio (M1T), mutaciones sin sentido (I58T, R96W, N106S), mutaciones sin sentido (L121*, L104*), mutaciones truncantes por cambio de marco (V182fs*5) y deleciones. Si bien R96W y M1T se asociaron con expansiones clonales, los eventos restantes afectaron a colonias individuales. Las diferencias tanto en las variantes somáticas como en el tamaño de los clones sugieren efectos funcionales variables de las mutaciones individuales de EIF6.

Para estudiar las consecuencias funcionales de las mutaciones de eIF6 en el ensamblaje de ribosomas, asignamos los residuos I58, N106 y R96 a la estructura crio-EM de 2,4 Å del complejo eIF6-60S humano (PDBID: 7OW7) (Fig. 5a-d). El residuo N106 de eIF6 se encuentra en la interfaz entre eIF6 y la proteína de la subunidad ribosomal 60S uL14, formando interacciones de enlace de hidrógeno (H) con los átomos de oxígeno de la columna vertebral de los residuos A133 y A136 de uL14 (Fig. 5b). Es probable que N106S reduzca la interfaz de enlace de hidrógeno entre eIF6 y uL14 para ayudar a su disociación21. De manera similar, la cadena lateral del residuo I58 forma interacciones hidrofóbicas con uL14, mientras que el oxígeno de la cadena principal de I58 forma un enlace H intraproteico con el nitrógeno de la cadena principal de R61 que a su vez forma una serie de enlaces H intraproteicos con los átomos de la cadena lateral y del esqueleto de N106 (Fig. 5c). La sustitución de isoleucina por la cadena lateral de treonina más polar en la variante I58T puede aumentar la solvatación y reducir la estabilidad de la interfaz eIF6-uL14. De hecho, las variantes I58T y N106S de eIF6 reducen la afinidad de eIF6 por la subunidad 60S en levaduras, Dictyostelium y células humanas8,21. De manera similar, la cadena lateral de R96 estabiliza la interacción polar entre eIF6 (residuo D78) y la proteína ribosómica eL24 (residuo K2), que probablemente se pierde al reemplazar la arginina con triptófano en la variante R96W (Fig. 5d).

un modelo atómico de eIF6 humano unido a la subunidad ribosomal 60S (PDBID: 7OW7). Protuberancia central del PC. Se predice que las interacciones estabilizadoras formadas por los residuos de eIF6 N106 (b), I58 (c) y R96 (d) se perderán con la mutación somática. Las figuras se generaron usando Pymol v1.2. eL24 es salmón coloreado; uL14, oro; eIF6, verde. e Se inmunotransfirieron extractos celulares de células HEK293T que expresan un vector vacío, eIF6-WT-FLAG humano o eIF6-M1T-FLAG mutante durante 24 h para detectar eIF6, FLAG y actina como control de carga. f, g Sobreexpresión de variantes de eIF6 en moscas WT. Los genotipos de las muestras de moscas se indican en la Tabla complementaria 2. f Se realizaron inmunotransferencias a extractos de larvas con los genotipos indicados para detectar las proteínas indicadas (mínimo 3 réplicas). Control, línea da-GAL4. g Proporción de genotipos de mosca indicados que se cerraron (mínimo 5 réplicas, mínimo n = 216; las barras de error representan la media ± DE). h Complementación genética de Drosophila deficiente en Sbds (Sbds P/P) con variantes de eIF6 relacionadas con SDS. Se muestra la proporción de genotipos indicados que se desarrollan hasta la etapa de pupa (mínimo 5 réplicas, mínimo n = 256; las barras de error representan la media ± DE; ***prueba t de dos colas, p(1) = 0,00060711; p(2) = 2,56426 E-07;p(3) = 2,3141E-13. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para evaluar la expresión de la variante eIF6 M1T, realizamos inmunotransferencia de extractos de células HEK293T humanas que expresan la proteína eIF6-M1T de tipo salvaje (WT) o marcada con FLAG. Confirmamos que la variante de pérdida de codón de inicio eIF6-M1T redujo significativamente la expresión de eIF6 como se anticipó (Fig. 5e), lo que indica además que un subconjunto de variantes sin sentido de EIF6 reduce la dosis de eIF618,21. También se esperaría que las variantes sin sentido (L104*, L121*), las mutaciones de cambio de marco que causan deleción o las deleciones genómicas de eIF6 reduzcan la dosis de eIF6 debido a la haploinsuficiencia de EIF6. La inmunotransferencia de extractos de células larvales de Drosophila reveló que la expresión de los mutantes eIF6-I58T y eIF6-N106S era comparable a la de eIF6-WT, pero la expresión de la variante eIF6-R96W se redujo (según lo detectado por el anticuerpo anti-FLAG) (Fig. 5f) . La expresión total de eIF6 (variante marcada con FLAG más proteína eIF6 endógena), detectada por el antisuero anti-eIF6, fue comparable para las variantes eIF6-WT, eIF6-I58T o eIF6-N106S, pero indetectable para eIF6-R96W (Fig. 5f a continuación) . Estos datos indican que la sobreexpresión transgénica de eIF6 WT o variantes no induce significativamente la expresión de la proteína eIF6 endógena. Es importante destacar que la sobreexpresión de WT eIF6, pero no las variantes de eIF6 (N106S, R96W e I58T), reduce la viabilidad de las moscas WT (Fig. 5g), lo que demuestra aún más que la sobreexpresión de las variantes de eIF6 no da como resultado una inducción funcionalmente significativa de la eIF6 endógena de Drosophila. proteína.

A continuación, probamos la capacidad de los mutantes eIF6-I58T, eIF6-R96W y eIF6-N106S para rescatar la letalidad larvaria de Drosophila21 deficiente en SBDS (Sbds P/P) en comparación con WT eIF6. Las moscas homocigotas con deficiencia de Sbds exhibieron un defecto de crecimiento severo, y solo el 5% de las larvas sobrevivieron hasta la etapa de pupa temprana (Fig. 5h). Si bien el eIF6 de tipo salvaje no logró rescatar el fenotipo letal deficiente en Sbds, eIF6-R96W, eIF6-N106S y, en menor medida, eIF6-I58T, rescataron una proporción de moscas que sobrevivieron hasta la etapa de pupa tardía (Fig. 5h) . En conjunto con experimentos genéticos previos en levadura8, nuestros datos sugieren que diferentes variantes de eIF6 tienen una potencia de rescate celular significativa pero variable en el SDS. Concluimos que las mutaciones somáticas de EIF6 compensan el defecto de maduración del ribosoma en SDS, ya sea reduciendo el número de copias del gen EIF6 presente en la célula o modulando el nivel de la proteína eIF6 o su función de unión a la subunidad 60S, lo que resulta en una restauración al menos parcial del ribosoma. homeostasis en SDS.

En este estudio, hemos demostrado que la fuerte presión selectiva para superar la biogénesis alterada de los ribosomas y evitar la muerte celular mediada por p53 en el SDS da como resultado mutaciones somáticas convergentes en un conjunto único de genes diana, no observados en el contexto del envejecimiento45,46,47 o perturbaciones hematológicas como la autoinmunidad48 o la quimioterapia49. La ventaja de supervivencia conferida por tales mutaciones da como resultado expansiones clonales de HSC, que a menudo comienzan muy temprano en la vida, incluso en el útero, en individuos con SDS. En la edad adulta temprana e incluso en la niñez, estimamos que casi la mitad de la hematopoyesis se deriva de una pequeña cantidad de HSC expandidas. Esto contrasta marcadamente con la hematopoyesis en individuos sanos que no desarrollan una oligoclonalidad comparable hasta las últimas décadas de la vida3,5.

Postulamos que el repertorio de mutaciones de genes diana bajo presión selectiva en SDS resalta varias rutas para mejorar la aptitud clonal (Fig. 6a, b). Las mutaciones pueden ser directamente compensatorias al aumentar la dosis genética de SBDS o EFL1 (Fig. 6b, '1'). El aumento en el número de copias del gen EFL1 debido a la aberración estructural del cromosoma 15 observada en este estudio (en el contexto de mutaciones de la línea germinal SBDS) es distinto de los cambios somáticos en el número de copias de EFL1 debido a la disomía uniparental que se han informado en casos de SDS causados ​​por la línea germinal. Mutaciones EFL117. Las mutaciones somáticas adaptativas que reducen el número de copias del gen EIF6, reducen el nivel de la proteína eIF6 o alteran su actividad de unión a la subunidad 60S, pueden reducir el requisito de que SBDS y EFL1 funcionales liberen eIF6 de la subunidad ribosomal 60S (Fig. 6b, '2' ). Se podría esperar que cada una de estas rutas ayudara a restaurar la homeostasis de los ribosomas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que esta mejora de la aptitud física se produce en el contexto del estado de la enfermedad SDS y, aunque se puede aumentar la dosis del gen somático SBDS, esto implica una variante del alelo hipomórfico que se espera que sea sólo parcialmente reparadora. De manera similar, la alteración de la copia del gen EIF6 o la alteración de la función es restaurativa, pero en el contexto de la deficiencia de SBDS. Por lo tanto, ni la restauración ni otros cambios observados necesariamente rescatarían todas las deficiencias funcionales de las células hematopoyéticas SDS.

a El ensamblaje defectuoso de ribosomas de la línea germinal en SDS promueve el estrés nucleolar a través de la unión inhibidora del complejo 5S RNP (que consiste en el ARNr 5S, uL5, codificado por RPL11 y uL18, codificado por RPL5) a la ligasa E3 nuclear HDM2 (mejorada por eL22, codificada por RPL22), promoviendo la acumulación de p53 y la apoptosis22. b La evolución convergente de mutaciones somáticas restaura la homeostasis de los ribosomas, favoreciendo la ubiquitinación y degradación de p53 dependiente de HDM2, a través de múltiples eventos de rescate genético somático independientes que incluyen: (1) dosis aumentada de proteínas SBDS o EFL1 (2) dosis reducida de eIF6 o unión de eIF6 al 60S subunidad; (3) unión inhibidora interrumpida de HDM2 a p53 a través de mutaciones en RPL5 y RPL22 50; (4) mutaciones de TP53. Ub ubiquitina.

El ensamblaje defectuoso de ribosomas activa la apoptosis inducida por p53 a través de la vía de vigilancia nucleolar. Las proteínas ribosomales uL18 (codificada por RPL5) y uL5 (codificada por RPL11) se unen al ARN 5S para formar el complejo de ribonucleoproteína 5S pre-ribosomal (5S-RNP) que inhibe la ubiquitina ligasa E3 HDM2 para estabilizar la proteína p5322 (Fig. 6a). ). eL22 (codificado por RPL22) también puede inhibir el circuito HDM2-p5350. Por lo tanto, las mutaciones somáticas en los reguladores de la vía de señalización nucleolar, como RPL5 y RPL22, pueden alterar la estabilización de p53 inducida por el estrés nucleolar (Fig. 6c, '3') o las mutaciones en el propio TP53 pueden permitir que las células sobrevivan a pesar del deterioro continuo de la síntesis de proteínas. (Figura 6b, '4'). La identificación de mutaciones recurrentes en RPL5 y RPL22 en este estudio puede reflejar el uso de la secuenciación del genoma completo versus el enfoque de secuenciación del exoma utilizado por Kennedy et al.18. Aunque son más especulativas, las mutaciones en el factor de empalme PRPF8 conservado evolutivamente también pueden alterar el empalme de componentes del eje p53-HDM2, incluidos uL18, uL5 o el propio p5351. Las mutaciones recurrentes de CSNK1A1 identificadas por Kennedy et al.18 (pero no en este estudio) pueden reflejar potencialmente el papel de la caseína quinasa en la maduración de la subunidad ribosómica 40S52.

La mutación somática facilita la entrada de la mutación conductora, proporcionando un sustrato para la selección clonal. Las estimaciones del número de HSC en humanos sanos sugieren que en la edad adulta están presentes entre 50 000 y 200 000 HSC singularmente identificables y que contribuyen activamente1,3. Con HSC individuales acumulando ~15 mutaciones somáticas/año1,3, uno esperaría que ~1 a 3 millones de mutaciones somáticas ingresaran al conjunto de HSC por año, de las cuales se esperaría que ~10 000 a 30 000 aterrizaran en la secuencia de codificación cada año. Este número de mutaciones esperadas es aún mayor que la huella codificante de muchos genes, lo que hace posible que una mutación somática no sinónima pueda aterrizar en un solo gen, como TP53 (longitud CDS 1182 pb), en una HSC dentro del conjunto de células madre cada año. año. Por lo tanto, es muy probable que las oportunidades de mutación somática estocástica de genes en HSC sean significativamente mayores de lo apreciado, lo que resulta en un mosaico somático extenso dentro de nuestro conjunto de HSC. Esto puede explicar la alta prevalencia y recurrencia de mutaciones conductoras en individuos con SDS cuando existe una fuerte selección que facilita su expansión clonal después de la adquisición. Una hipótesis interesante a probar es si el número de mutaciones somáticas observadas en casos de SDS a una edad temprana podría reflejar, al menos en parte, la incapacidad del sistema inmunológico en el SDS para eliminar células rebeldes con mutaciones conductoras.

La naturaleza estocástica de la adquisición de mutaciones conductoras somáticas, desde los primeros años de vida, también puede explicar la considerable heterogeneidad en el fenotipo clínico, incluso entre hermanos con SDS con el mismo genotipo de línea germinal13. No se capturó evidencia de una fuerte selección clonal en todos los individuos con SDS, ya que tres individuos en la cohorte no albergaban expansiones clonales detectables ni mutaciones conductoras (Fig. 2). SDS1 fue el individuo más joven de nuestra cohorte (4,2 años) y, por lo tanto, puede haber tenido menos tiempo para adquirir mutaciones conductoras y expansiones clonales. Alternativamente, es posible que se hayan pasado por alto expansiones clonales debido a una combinación del pequeño tamaño de la muestra (n = 18 colonias) y una mayor diversidad clonal de HSC esperada en individuos más jóvenes3. SDS3 fue el único individuo sin el alelo SBDS c.183_184TA > CT, sino que portaba dos mutaciones de la línea germinal SBDS (c.258 + 2T > C, c.258 + 1G > C) que alteran el sitio de empalme del donante del intrón 27. SDS9 era uno de los individuos de mayor edad en nuestra cohorte (26,2 años) y Kennedy et al.18 también observaron individuos similares que carecían de mutaciones conductoras. En el futuro, será interesante determinar si los individuos que progresan a aplasia de la médula ósea representan un subconjunto específico de la evolución de la enfermedad SDS donde la expansión clonal mediada por la mutación impulsora ha sido insuficiente para mitigar el fenotipo de insuficiencia de la médula ósea.

Aunque nuestro estudio está limitado por la pequeña cohorte de individuos incluidos y la falta de muestreo longitudinal, tecnologías como la secuenciación de una sola molécula39,53 evitarán el requisito de expansiones clonales para la detección de mutaciones impulsoras que pueden ayudar a dilucidar el espectro completo de genes diana. que proporcionan fitness en SDS. La caracterización de diferentes trastornos congénitos de insuficiencia de la médula ósea también puede ayudarnos a comprender la naturaleza de la ventaja selectiva proporcionada por las mutaciones conductoras asociadas con la hematopoyesis clonal observadas ocasionalmente en este y en un estudio anterior18.

Clínicamente, los individuos con SDS merecen una estrecha vigilancia de los clones emergentes mediante la secuenciación genética extendida regular de la sangre, dada la gran cantidad de expansiones clonales monoalélicas de TP53 que muchos tienen, cada una de las cuales sirve potencialmente como sustrato para la evolución clonal hacia una enfermedad agresiva. Nuestro estudio y otros18 sugieren que un mecanismo clave de transformación en SDS es la adquisición de TP53 mutado bialélico. Dado el crecimiento clonal y la evolución genómica muy rápidos observados, puede justificarse la consideración de una intervención terapéutica temprana, como el trasplante de médula ósea, dado el mal pronóstico asociado con los cánceres mieloides con mutación TP5335,54,55,56,57,58 y la enfermedad transformada. en SDS36.

Nuestra investigación cumple con todas las normas éticas pertinentes. Las personas con SDS (n = 10) participaron prospectivamente en el estudio luego de la aprobación y el consentimiento total del Comité de Ética en Investigación (aprobaciones del Comité de Ética en Investigación del NHS 07/MRE05/44 (Cambridge South), 11/LO/0512 (London Riverside), 12/ EE/0478 (Este de Inglaterra)). Cada individuo fue muestreado en un momento determinado, con excepción de SDS5, que fue muestreado en dos momentos temporales. El material incluyó sangre periférica y/o médula ósea e hisopos bucales de cada individuo. La recolección de muestras, el procesamiento inicial de muestras y el banco de muestras fueron realizados por el Biobanco de células madre y sangre de Cambridge con la aprobación apropiada del comité de ética de investigación del NHS (18/EE/0199 (este de Inglaterra). Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para utilizar los materiales para la investigación. realizados aquí y publicar los resultados sin compensación.

La inmunofenotipificación por citometría de flujo de HSPC se realizó en células mononucleares viables (MNC) almacenadas y congeladas de muestras de PB y/o BM obtenidas de individuos con SDS de 4 a 33 años o de donantes sanos/sin SDS de 29 a 32 años (STEMCELL Technologies) . Las CMN de donantes sanos (sin SDS) se tiñeron con anticuerpos: CD3-FITC (clon HIT3a, BD #555339; dilución 1:500), CD90-PE (clon 5E10, Biolegend, #328114; 1:33), CD49f- PECy5 (clon GoH3, BD #551129; 1:100), CD38-PECy7 (clon HIT2, Biolegend, #303516; 1:100), CD33-APC (clon WM53, BD #571817; 1:200), CD19-A700 (clon HIB19, Biolegend #302226; 1:300), CD34-APCCy7 (clon 581, Biolegend #343514; 1:100), CD45RA-BV421 (clon HI100, Biolegend #304130; 1:100) y Zombie Aqua (Biolegend #423101; 1:2000). Las CMN de individuos con SDS se tiñeron con los siguientes anticuerpos: CD38-FITC (clon HIT2, BD #555459; 1:12.5), CD34-PE-Cy7 (clon 8G12, BD #348811; 1:33), CD10-BV605 ( clon HI10a, Biolegend #312222: 1:33), CD45RA-V450 (clon HI30, BD #560367; 1:100), CD90 APC (Clon 5E10, Biolegend #328110; 1:50), CD3-APC-Cy7 (clon SK7, Biolegend #344818; 1:50) y CD19-APC-Cy7 (clon HIB19, Biolegend #302218, 1:50). Después de seleccionar singletes vivos (7AAD o Zombie negativos) y excluir las células positivas para CD3/CD19, se seleccionaron los progenitores positivos para CD34 en masa (Figura 1 complementaria).

Estudios anteriores han demostrado que las fracciones clonales mutantes son equivalentes cuando las células madre o progenitores provienen de sangre periférica o médula ósea1,3. Se recogieron muestras de PB o BM en tubos de heparina de litio (LiHep), las MNC se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad y los glóbulos rojos se lisaron en NH4Cl. Las células de la fracción MNC (o células CD34+ para un individuo) se sembraron en MethoCult H4435 (STEMCELL) para cultivo in vitro y expansión clonal (ensayo de células formadoras de colonias (CFC)) utilizando una amplia gama de diluciones celulares para garantizar la adecuada Densidad de siembra para recoger colonias derivadas de una sola célula. Después de 2 a 3 semanas en el ensayo CFC, se recogieron colonias hematopoyéticas individuales en PBS o tampón ProteinaseK (kit de extracción de ADN Arcturus Picopure, Applied Biosystems) y se almacenaron a -20 °C para la posterior secuenciación del ADN del genoma completo (WGS) (Fig. .1). En dos muestras, se iniciaron cultivos líquidos unicelulares con células lin-CD34+CD38+CD90- individuales utilizando los siguientes anticuerpos: CD38-FITC (clon HIT2, BD, San José, CA, EE. UU.; n.° 555459; 1:12,5) , CD34 PerCp-Cy5.5 (Clon 581, Biolegend #343522; 1:33, San Diego, EE. UU., CD90-APC (Clon 5E10, Biolegend #328114; 1:33), después del enriquecimiento previo para células CD34+ (EasySep Human CD34 Positive Selection Kit, STEMCELL). Las HSPC individuales (lin-CD34+CD38+CD90-) se clasificaron por flujo usando un clasificador BD Influx y se cultivaron en StemSpan suplementado con citoquinas y factores de crecimiento recombinantes SCF, FLT3L, IL3 e IL6 (cc100, CÉLULA MADRE).

El ADN de las colonias de CFC seleccionadas se extrajo utilizando el kit de extracción de ADN Arcturus Picopure (Applied Biosystems). Se utilizó el kit DNAeasy (Qiagen) para la extracción de colonias de CFC recogidas en PBS. El ADN de los hisopos bucales se aisló utilizando el microkit QIAmp DNA (Qiagen Cat. 56304).

Las colonias individuales se sometieron a una secuenciación del genoma completo para identificar variantes somáticas de un solo nucleótido (SNV), variantes de la línea germinal, inserciones/deleciones y variantes estructurales. Generamos lecturas de secuenciación de extremos emparejados de 150 pb utilizando máquinas Illumina X Ten, lo que resultó en una cobertura media de ~20x por muestra. Las secuencias se alinearon con el genoma humano de referencia GRCh37d5 utilizando el algoritmo BWA-MEM59,60. Después de la eliminación de colonias debido a la baja profundidad de secuenciación (menos de 6x) y la baja clonalidad (frecuencia media de alelos variantes inferior a 0,4), se llevaron a cabo 323 colonias (rango de 10 a 100 por individuo, media de 32 por individuo) para su posterior análisis.

Se identificaron variantes de un solo nucleótido (SNV) utilizando CaVEMan61 para cada colonia en comparación con una muestra in silico no compatible (PD37I). CaVEMan se ejecutó con el parámetro "contaminación normal del tumor" establecido en cero y los números de tumor/copia normal establecidos en 5/2. Además de los filtros estándar, las lecturas que admitían un SNV debían tener una puntuación de alineación BWA-MEM mediana ≥ 140 y menos de la mitad de las lecturas recortadas. También se aplicó un filtrado diseñado para el control de calidad después del procesamiento a través del sistema de secuenciación de bajo insumo Sanger62. El uso de la normal incomparable significó que este proceso llamara SNV tanto somáticos como germinales. La eliminación de SNV de la línea germinal y los artefactos de secuenciación requirió un filtrado adicional. Como se publicó4, utilizamos información agrupada entre colonias y leímos recuentos de una muestra bucal WGS de línea germinal coincidente para garantizar que las variantes somáticas genuinas que pueden haber estado presentes en la muestra de línea germinal, ya sea como variantes embrionarias o debido a una contaminación normal del tumor, también estuvieran presentes. identificado. Las inserciones y eliminaciones breves se realizaron utilizando cgpPindel63 con los filtros WGS cgpPindel VCF estándar aplicados, excepto que el filtro F018 Pindel se deshabilitó porque excluye loci de profundidad <10. Las aberraciones en el número de copias (CNA) se identificaron utilizando ASCAT64 en comparación con una muestra normal coincidente. Luego se tomó la unión de los SNV de la colonia y las inserciones-eliminaciones (indeles) y se contaron las lecturas en todas las muestras pertenecientes al individuo (colonias y muestras bucales) utilizando VAFCorrect.

BRASS65 denominó variantes estructurales (SV). Eliminamos artefactos de las llamadas SV usando AnnotateBRASS (https://github.com/MathijsSanders/AnnotateBRASS66) con la configuración predeterminada.

El genotipo en cada locus dentro de cada muestra fue 1 (presente), 0 (ausente) o NA (desconocido). Inferimos el genotipo de una manera sensible a la profundidad. Supusimos que el recuento de lecturas de mutantes observado para una colonia en un sitio determinado era MTR ~ Binomial (n = Profundidad, p = VAF esperado), si el sitio era mutante, y MTR ~ Binomial (n = profundidad, p = 0,01), si el sitio era de tipo salvaje. El genotipo se estableció en el más probable de los dos estados posibles, siempre que uno de los estados fuera al menos 20 veces más probable que el otro. De lo contrario, el genotipo se establece como faltante (NA). El VAF esperado era generalmente 0,5 para los sitios autosómicos, pero para los sitios de los cromosomas X, Y y CNA, se estableció en 1/ploidía. Para los sitios de pérdida de heterocigosidad (LOH), el genotipo se anuló y se estableció como faltante si originalmente era 0.

Construimos topologías de árboles filogenéticos utilizando la máxima parsimonia con MPBoot67. Las entradas para MPBoot fueron las matrices de genotipo binario con valores faltantes por individuo. Sólo se utilizaron SNV para inferir la topología, pero posteriormente tanto los SNV como los indeles se asignaron a las ramas de los árboles filogenéticos.

Luego, las mutaciones se asignaron al árbol de manera sensible a la profundidad usando treemut (https://github.com/nangalialab/treemut4) y las mutaciones se asignaron de manera difícil a la rama de mayor probabilidad. Además, las longitudes de las ramas se ajustaron para la sensibilidad de detección de SNV específica de la rama4, donde la sensibilidad de detección de variantes de SNV completamente clonales se estimó directamente a partir de la sensibilidad por colonia para detectar SNV heterocigotos de línea germinal junto con una corrección multiplicativa para la clonalidad (VAF) de la colonias. Al calcular la carga de mutaciones y las longitudes de las ramas, el número de copias de las regiones que están presentes en cualquier colonia de un individuo se enmascaran uniformemente en todas las colonias de ese individuo y luego la carga de mutaciones general se vuelve a aumentar mediante el recíproco de 1: número esperado de mutaciones en la región enmascarada.

Además de los SNV y los indeles, las colonias exhibieron una variedad de eventos LOH y CNA. Estos eventos se seleccionaron como presentes o ausentes en cada una de las colonias, dando un vector de genotipo de evento similar al obtenido para SNV e indeles. Una vez que se infirió la topología del árbol utilizando los genotipos SNV, se identificaron las ramas que coincidían exactamente con el genotipo del evento y se asignó el evento a la rama correspondiente.

Dada la acumulación lineal de mutaciones somáticas con la edad, podemos inferir el momento de la vida en el que se produjeron las mutaciones impulsoras en los árboles filogenéticos. Las ramas en la parte superior de un árbol comprenden mutaciones adquiridas a una edad temprana, y las ramas más abajo representan mutaciones que surgen más adelante en la vida.

Hemos desarrollado un método formal basado en modelos rtreefit (https://github.com/nangalialab/rtreefit) para convertir árboles donde las longitudes de las ramas se expresan en tiempo molecular (es decir, número de mutaciones) en árboles donde las longitudes de las ramas se expresan en unidades. de tiempo (años)4. En resumen, el método ajusta conjuntamente una única tasa de mutación constante (es decir, el número de SNV acumulados por año) y longitudes de rama en tiempo absoluto utilizando un modelo bayesiano basado en árbol individual bajo el supuesto de que el número de mutaciones observadas asignadas a una rama es Poisson. distribuido con Media = Duración de la rama × Sensibilidad × Tasa de mutación, y sujeto a la restricción de que la duración de la raíz a la punta es igual a la edad en el momento del muestreo. Además, el método tiene en cuenta una tasa de mutación elevada durante la embriogénesis al suponer una tasa de mutación excesiva durante el desarrollo.

El algoritmo rtreefit se ejecutó con 4 cadenas y 20.000 iteraciones por cadena.

Buscamos específicamente mutaciones impulsoras de puntos críticos, cambios en el número de copias y reordenamientos en 35 genes que se sabe que están asociados con neoplasias hematológicas35 y hematopoyesis clonal33,34 (ASXL1, BCOR, CALR, CBL, CSF3R, CUX1, DNMT3A, EZH2, GATA2, GNAS, GNB1 , IDH1, IDH2, JAK2, KIT, KRAS, MLL3, MPL, NF1, NFE2, NRAS, PHF6, PPM1D, PTPN11, RB1, RUNX1, SETBP1, SF3B1, SRSF2, SH2B3, STAG2, TET2, TP53, U2AF1, ZRSR2) como así como en los genes mutados recurrentemente identificados en SDS. Identificamos mutaciones somáticas bajo selección positiva y negativa utilizando dNdScv68.

Caracterizamos los perfiles mutacionales presentes en nuestro conjunto de datos realizando la extracción de firmas con hdp (https://github.com/nicolaroberts/hdp) sin ninguna firma como antes y sin una agrupación especificada de los datos. Para evitar un doble conteo, las mutaciones compartidas entre colonias se asignaron aleatoriamente a una colonia. hdp identificó la presencia de 2 firmas mutacionales, una con gran similitud con las firmas cósmicas SBS142 (similitud de coseno ≥0,95) y otra con gran similitud con SBSblood1,2,41 (similitud de coseno ≥0,91). Luego estimamos la proporción de firmas mutacionales SBS1 y SBSblood presentes en cada colonia utilizando el programa sigfit 69.

Definimos la sobredispersión en la carga de mutaciones como la relación entre la varianza de la carga esperada y la varianza de Poisson. Estimamos la sobredispersión en función de la edad utilizando datos de colonias unicelulares de sangre sanas/sin SDS informadas en Mitchell et al.3. La sobredispersión intraindividual en cada momento se estima como la varianza de la carga de mutación de la muestra dividida por la carga de mutación media de la muestra. Luego se modeló la sobredispersión logarítmica utilizando un modelo lineal con la edad como variable explicativa. La sobredispersión estimada a los 25 años es de 2,24 (1,85-2,73). Para efectos de evaluar la significación estadística de la aparentemente alta carga de mutación de SDS8, tomamos en cuenta de manera conservadora el muy alto grado de historia compartida de las colonias de SDS8 considerando el clado como una sola célula con una carga dada por la carga media, y luego evaluamos la probabilidad de observar una carga de mutaciones tan extrema (n = 905) bajo la hipótesis nula de que las mutaciones se acumularon de acuerdo con una distribución binomial negativa con una media igual al número esperado de mutaciones (n = 496) y una varianza que es 2,24 veces el significado.

Suponemos que hay un evento de transformación único que activa un proceso mutacional que es responsable del perfil de firma distintivo (firma de transformación) observado en el clado expandido (Figura complementaria 4). Luego estimamos el momento de este evento como la edad que corresponde al número de mutaciones del tronco que se pueden atribuir al perfil de firma compuesto de la hematopoyesis SDS normal (SDS6, SDS7 y SDS9) (firma SDS compuesta de la misma edad). El número de mutaciones del tronco de la firma SDS compuesta de la misma edad acumuladas se estima utilizando el paquete R sigfit69 para descomponer los SNV del tronco en contribuciones de la firma SDS compuesta de la misma edad y la firma de transformación. Luego estimamos la edad correspondiente utilizando el cálculo bayesiano aproximado con el método de rechazo, lo que requiere que el número de sustituciones adquiridas desde el nacimiento siga una distribución binomial negativa con una media = edad en el momento de la transformación × tasa de mutación y una varianza establecida en 2,24 veces la media (ver sección anterior). La tasa de mutación en sí se extrae de una distribución normal con media de 15,1 y varianza de 1. La estimación de edad incondicional utiliza un rango de edad anterior uniforme de 0 a 100 años, mientras que la estimación de edad condicional utiliza un rango previo uniforme de 0 a 25 años. Estimamos un árbol ultramétrico usando rtreefit4 (con la edad de transformación restringida al límite inferior del IC del 95% para la estimación de edad condicional (19,3 años). Luego se usó el método phylofit3 para estimar la tasa de crecimiento del clon usando el tiempo y el patrón. de coalescencias. Los detalles completos se pueden encontrar en https://github.com/nangalialab/ShwachmanDiamond.

El ADNc para eIF6 WT humano que porta una etiqueta FLAG C-terminal se generó mediante PCR utilizando el kit Phusion High-Fidelity PCR (NEB). Luego, el producto de la PCR se insertó en pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific) usando los sitios BamHI/XhoI, generando el plásmido pEIF6-WT-FLAG). Se realizó mutagénesis dirigida al sitio para generar el mutante eIF6 M1T (plásmido pEIF6-M1T-FLAG) utilizando el kit de PCR Phusion High-Fidelity (Thermo Fisher Scientific). Los cebadores fueron los siguientes (5' a 3'):

eIF6-WT-Fw,TACTGGATCCATGGCGGTCCGAGCTTCGTC

eIF6-WT-FLAG-Rev,AGTACTCGAGTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGGTGAGGCTGTCAATGAGGGAATC) eIF6-M1T-Fw,CGGATCCACGGCGGTCCGAGCTTCGTTCGAGAACAA

eIF6-M1T-Rev, GGACCGCCGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAA

Se cultivaron células HEK293T (Sigma, 12022001) en una placa de 12 pocillos hasta aproximadamente un 80 % de confluencia, seguido de transfección de plásmido utilizando lipofectamina 2000 (Thermo Fisher Scientific) durante 24 h. Las células se lavaron en PBS 1x y se lisaron en NP-40 al 0,5% durante 30 minutos en hielo. Los lisados ​​se centrifugaron a 21.130 x g durante 10 minutos y el sobrenadante se mezcló con DTT 50 mM y 4x tampón de muestra NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific) a 1x. Las muestras se incubaron a 70 °C durante 10 min. Las proteínas se separaron en un gel NuPAGE 4–12% Bis-Tris (Thermo Fisher Scientific) en 1x tampón de ejecución MES (Formedium) antes de transferirlas a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema iBlot 2 (Thermo Fisher Scientific). La membrana se bloqueó con leche al 5% (p/v) disuelta en tampón PBST (1x PBS con Tween 20 al 0,1% [v/v]) durante 1 h. Las proteínas humanas se visualizaron utilizando anticuerpos anti-FLAG (Sigma, #F7425, dilución 1:5000), anti-eIF6 (GenTex, #GTX117971) y anti-actina (Sigma, #A2066), ambos a una dilución 1:1000. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo anti-IgG de conejo unido a HRP (Cell Signalling, n.° 7074; 1:5000). Las transferencias se desarrollaron con el sustrato Western Chemiluminescent HRP (Immobilon) y se visualizaron utilizando el sistema de imágenes Chemidoc™ MP (Bio-Rad). El análisis se realizó utilizando el software Image Lab v6.0.1 (Bio-Rad).

Se recogieron larvas del tercer estadio de Drosophila (típicamente 15 larvas), se lavaron con PBS, se homogeneizaron en tampón de lisis (HEPES 20 mM, pH 7,4, KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, IGEPAL® CA-630 al 0,5 % (v/v) (Sigma, #I8896), desoxicolato de sodio al 0,5% (p/v) (Sigma, #30970) con inhibidores de proteasa completos sin EDTA (Roche) y se incubaron durante 15 minutos en hielo. Los lisados ​​se aclararon en una microcentrífuga a 20.000 × g durante 10 minutos. a 4 ° C. Se cargaron cantidades iguales (típicamente 10 µg) de proteína total y se separaron usando SDS-PAGE para inmunotransferencia. Las proteínas de Drosophila se visualizaron usando anti-Gapdh (Merck #G9545, dilución 1:20,000), anti-eIF6 (GeneTex , #GTX117971, dilución 1:1000) y anticuerpos anti-FLAG (Abcam, dilución 1:20 000). Todos los anticuerpos secundarios se utilizaron a una dilución 1:10 000: IgG anti-ratón, conjugada con HRP (Sigma-A5287), anti- IgG de conejo, conjugado con HRP (Cell Signaling 7074), IgG anti-cabra, anticuerpo conjugado con HRP (Santa Cruz, sc-2020). Las transferencias se desarrollaron con el sustrato quimioluminiscente SuperSignal™ West Pico PLUS (Thermo Fisher, #34580), y visualizado utilizando un sistema de imágenes Chemidoc™ MP (Bio-Rad). El análisis se realizó utilizando el software Image Lab v6.0.1 (Bio-Rad).

Las moscas se mantuvieron utilizando técnicas de cultivo estándar. Todos los cruces se realizaron a 25 °C. Las cepas y genotipos de moscas se describen en las Tablas complementarias 2 y 3. Las líneas de Drosophila SbdsP, UAS-EIF6-FLAG, UAS-EIF6-R96W-FLAG, UAS-EIF6-N106S-FLAG se describen en la Tabla complementaria 3. Para generar la UAS -Línea transgénica EIF6-I58T-FLAG, la secuencia codificante de Drosophila EIF6 (NM_145105) se amplificó mediante PCR a partir de ADNc18 de larva de Drosophila. La variante EIF6I58T se generó mediante mutagénesis dirigida al sitio de PCR y se subclonó en pTWF (colección de vectores The Drosophila Gateway) para generar el plásmido pUAS-EIF6-I58T-FLAG para microinyección. La línea transgénica pUAS-EIF6-I58T-FLAG fue generada mediante transformación de la línea germinal mediada por el elemento P en la cepa aw 1118 por BestGene Inc. Los cebadores oligonucleotídicos utilizados para generar las cepas de Drosophila fueron los siguientes (5' a 3'): EIF6-F: CACCATGGCTCTACGCGTCC; EIF6-R: GGACATGTCCTCGATGAGGGC; EIF6-I58T-F: CTGCCGGACAATCGGCCGCC; EIF6-I58T-R: GCCGATTGTCCGGCAGCCG. La línea da-GAL4 se utilizó para inducir la expresión ubicua de variantes de eIF6 marcadas con FLAG bajo el promotor UASt.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación sin procesar de todos los genomas completos están disponibles en el Archivo Europeo Genoma-Fenoma (número de acceso EGAD00001009061. El acceso a estos datos humanos alojados en EGA está restringido debido a su sensibilidad y, por lo tanto, se gestiona de acuerdo con la Política de intercambio de datos de Wellcome Sanger Los investigadores interesados ​​en acceder a los datos deben enviar una solicitud de acceso a los datos a Sanger a través de eDAM2 (https://edam.sanger.ac.uk/). Se pueden encontrar más detalles en https://www.sanger.ac.uk/ about/edam2-guide/#02-04. Cuando se recibe una solicitud, el equipo de acceso a datos realiza una variedad de comprobaciones, por ejemplo, la identidad del solicitante como investigador auténtico, su afiliación y el proyecto que describe en su solicitud. está en línea con cualquier restricción de uso asociada con los conjuntos de datos que han solicitado. No hay límite de tiempo para el acceso a los datos; los acuerdos de acceso a los datos son perpetuos y se ejecutan hasta su terminación. Sin embargo, el acceso a los datos estaría asociado con (1) un proyecto específico, por lo que solo se puede utilizar para ese proyecto mientras se ejecute y (2) la dirección de correo electrónico institucional del investigador, por lo que si cambia de afiliación, perderá el acceso a los datos y deberá volver a solicitarlos acceso bajo su nueva afiliación. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Puede encontrar un repositorio del código para realizar todos los análisis en https://github.com/machadoheather/somatic_evolution_SDS (https://doi.org/10.5281/zenodo.8172028)70 y https://github.com/nangalialab /ShwachmanDiamond (https://doi.org/10.5281/zenodo.8172581)71.

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Descargar referencias

JN cuenta con el apoyo de una beca de Cancer Research UK y el trabajo en el laboratorio de JN cuenta con el apoyo de Wellcome Trust, Cancer Research UK, Alborada Trust, Rosetrees Trust y MPN Research Foundation. El trabajo en el laboratorio DGK cuenta con el apoyo de una subvención inicial del Consejo Europeo de Investigación (ERC-2016-STG-715371), la Fundación Bill y Melinda Gates (INV-002189 e INV-038816) y un premio de la Fundación del Programa Cancer Research UK (DCRPGF). 100008). AJW recibió el apoyo de una subvención de continuidad del programa Blood Cancer UK (21002 para AJW), el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (MR/T012412/1), el Kay Kendall Leukemia Fund, Rosetrees Trust, la SDS Foundation, el Shwachman-Diamond Project, el Butterfly Guild, SDS UK, el Proyecto Connor Wright, el Centro de Investigación Biomédica del Instituto Nacional de Investigación en Salud de Cambridge y la Acción CA18233 de la Cooperación Europea en Ciencia y Tecnología (COST) “Red europea para el diagnóstico y tratamiento innovadores de neutropenias crónicas, EuNet INNOCHRON” y CA21154, “Control traslacional en Cáncer Red Europea, TRANSLACORE”. Las muestras fueron proporcionadas por el Biobanco de células madre y sangre de Cambridge, que cuenta con el apoyo del Centro de investigación biomédica NIHR de Cambridge, el Instituto de células madre Wellcome Trust-MRC y el Centro de medicina experimental contra el cáncer de Cambridge, Reino Unido. Los autores también desean agradecer a las personas por donar las muestras que se utilizaron en este estudio.

Estos autores contribuyeron igualmente: Heather E. Machado, Nina F. Øbro, Nicholas Williams, Shengjiang Tan.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: David G. Kent, Jyoti Nangalia, Alan J. Warren.

Instituto Wellcome Sanger, Campus Wellcome Genome, Hinxton, Reino Unido

Heather E. Machado, Nicholas Williams, Emily Mitchell, Peter J. Campbell y Jyoti Nangalia

Bienvenido MRC Cambridge Stem Cell Institute, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Megan Davies, Miriam Belmonte, Emily Mitchell, Nicole Mende, Anna Clay, Elisa Laurenti, David G. Kent, Jyoti Nangalia y Alan J. Warren

Departamento de Hematología, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Nina F. Øbro, Shengjiang Tan, Ahmed Z. Boukerrou, Megan Davies, Miriam Belmonte, E. Joanna Baxter, Nicole Mende, Anna Clay, Elisa Laurenti, David G. Kent, Jyoti Nangalia y Alan J. Warren

Departamento de Inmunología Clínica, Hospital Universitario de Copenhague, Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca

Nina F. Øbro

Instituto de Investigación Médica de Cambridge, Edificio Keith Peters, Cambridge, Reino Unido

Shengjiang Tan, Ahmed Z. Boukerrou y Alan J. Warren

Departamento de Hematología, Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Philip Ancliff y Jutta Köglmeier

Hospitales Universitarios Dorset NHS Foundation Trust, Royal Bournemouth Hospital, Bournemouth, Reino Unido

Sally B. Killick

Departamento de Medicina Hematológica, King's College Hospital NHS Foundation Trust y King's College London, Londres, Reino Unido

Austin Kulasekararaj

División de Ciencias del Cáncer, Facultad de Ciencias Médicas, Facultad de Biología, Medicina y Salud, Universidad de Manchester, Centro de Investigación del Cáncer de Manchester, Wilmslow Road, Manchester, Reino Unido

Esteban Meyer

Departamento de Hematología y Oncología Pediátrica, Royal Manchester Children's Hospital, Manchester Foundation Trust, Manchester, Oxford Road, Manchester, Reino Unido

Esteban Meyer

Oncología de adolescentes y adolescentes, The Christie NHS Foundation Trust, Wilmslow Road, Manchester, Reino Unido

Esteban Meyer

Instituto de Investigación Biomédica de York, Departamento de Biología, Universidad de York, York, Reino Unido

David Kent

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HEM y NW realizaron análisis genómicos; NF Ø. desarrolló ensayos clonales y realizó análisis fenotípicos con la ayuda de MD, MB y AC; ST y AZB realizaron ensayos funcionales de eIF6; EJB, MD y AC ayudaron con la generación de muestras; EM, MD, AC, NM y EL compartieron datos WGS de individuos normales; PA, JK, SBK, AK, SM y AJW proporcionaron muestras; PJC, DGK, JN y AJW supervisaron el estudio. HEM, JN, DGK y AJW escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a David G. Kent, Jyoti Nangalia o Alan J. Warren.

AJW y ST son consultores de SDS Therapeutics. PJC es cofundador y accionista de FL86 Inc. Los autores restantes no declaran intereses en competencia.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Machado, HE, Øbro, NF, Williams, N. et al. La evolución somática convergente comienza en el útero en una ribosopatía de la línea germinal. Nat Comuna 14, 5092 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40896-5

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Recibido: 04 de octubre de 2022

Aceptado: 14 de agosto de 2023

Publicado: 22 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40896-5

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